代躍廳，韓巨才，劉慧平

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山西 太谷030801）

植物病害是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的大敵，使糧食產(chǎn)量遭受了嚴(yán)重的損失，據(jù)聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織（FAO）統(tǒng)計(jì)，每年因植物病害造成的平均損失為總產(chǎn)量的10%～15%［1］。其中80%以上的植物病害則是由真菌引起的。真菌病害是阻礙植物生長(zhǎng)、影響作物產(chǎn)量的主要因素［2］，控制真菌病害對(duì)于提高農(nóng)作物產(chǎn)量極為重要。長(zhǎng)期以來植物病害主要以化學(xué)藥劑來防治，一方面容易造成病原菌抗藥性的產(chǎn)生，增加防治成本，另一方面容易給環(huán)境造成污染。因此，符合環(huán)保、健康、持續(xù)發(fā)展理念的高效、低毒、低殘留、與環(huán)境相容的農(nóng)藥的開發(fā)就成為當(dāng)今農(nóng)藥研究的主題。植物內(nèi)生細(xì)菌是一個(gè)多樣性十分豐富的生物類群，在植物內(nèi)生細(xì)菌中，有的是對(duì)植物病原菌產(chǎn)生拮抗而保護(hù)植物免受病原菌侵害的衛(wèi)士，有的可能對(duì)植物某些活性成分的形成具有重要的作用，有的可能產(chǎn)生與寄主植物類似的活性成分，并且具有對(duì)人、畜、農(nóng)作物和環(huán)境安全等特點(diǎn)。因此，利用生防細(xì)菌防治植物病害的這一系列優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究的重要方向［3，4］。許多拮抗細(xì)菌能產(chǎn)生對(duì)真菌病害起到抑制作用的次生代謝產(chǎn)物，已成為新的微生物源農(nóng)藥［5］，并顯示出良好的應(yīng)用前景［6，7］。微生物農(nóng)藥是利用微生物或其代謝產(chǎn)物來防治農(nóng)作物的病、蟲、草、鼠害及促進(jìn)作物生長(zhǎng)的一類農(nóng)藥。植物內(nèi)生細(xì)菌與寄主植物在長(zhǎng)期共同進(jìn)化過程中形成了密切的相互關(guān)系，是植物微生物生態(tài)系統(tǒng)的主要成員，對(duì)寄主植物有促生、防病、內(nèi)生聯(lián)合固氮等廣泛的生物學(xué)作用，是植物病害生物防治、內(nèi)生聯(lián)合固氮菌篩選、誘導(dǎo)抗病性及轉(zhuǎn)基因載體等功能的天然菌源，具有較高的理論研究?jī)r(jià)值和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，已成為微生物學(xué)、植物病理學(xué)植物學(xué)等多個(gè)學(xué)科的研究熱點(diǎn)［8～10］。

丹參作為中國(guó)的傳統(tǒng)中藥，在臨床上可用于治療心腦血管疾病、高血脂、急性缺血性中風(fēng)、月經(jīng)失調(diào)和抗炎等。最新研究表明，丹參還有保肝、抗腫瘤及抗氧化活性［11～14］。近年來，關(guān)于藥物植物內(nèi)生菌的多樣性和次生代謝成分的研究日益增多，但對(duì)丹參內(nèi)生細(xì)菌的研究卻很少。

作者從丹參植物葉片中分離得到一株內(nèi)生細(xì)菌DS－1，為了了解其抑菌活性，對(duì)該菌株及其發(fā)酵源液的抑菌活性進(jìn)行了初步研究。將為生防細(xì)菌的研究和開發(fā)利用提供有力的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株

梨黑斑病菌（Alter naria alter nata）、番茄早疫病菌（Alter naria sol ani）、小麥赤霉病菌（Fusarium gr aminear um）、黃瓜枯萎病菌（Fusarium osysporumf.sp.cucu merinum）、棉花立枯病菌（Rhizoctonia sol ani）、辣椒枯萎病菌（Fusarium oxysporum）、豆角菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum）、西瓜炭疽病菌（Colletotrichum orbicul are）、內(nèi)生細(xì)菌DS－1

1.1.2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)液，PDA 培養(yǎng)基［15］。

1.2 試驗(yàn)方法

菌株的抑菌效果采用平板對(duì)峙的方法：在無菌操作條件下，倒入PDA平板，冷卻。在PDA平板中間接種直徑5 mm的病原菌，在距離病原菌兩側(cè)各1.5 c m處接種內(nèi)生細(xì)菌，3組重復(fù)，以只接種病原菌為對(duì)照，在25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d，測(cè)定病原菌的菌落半徑，計(jì)算抑菌率。

內(nèi)生細(xì)菌發(fā)酵液活性測(cè)定采用生長(zhǎng)速率法。將內(nèi)生菌DS－1接種于LB培養(yǎng)液中，在30℃，180 r·min－1振蕩培養(yǎng)72 h，8000 r·min－1離心10 min后取出菌體獲得發(fā)酵液，一部分用0.22μm微孔濾膜過濾滅菌，一部分經(jīng)過高溫滅菌。按發(fā)酵液與PDA培養(yǎng)基1：9的比例混合制備平板，接入直徑為5 mm的病原菌，以無菌水為對(duì)照，25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d后測(cè)定菌落直徑，計(jì)算抑菌率。

2 結(jié)果與分析

2.1 對(duì)峙試驗(yàn)結(jié)果

DS－1對(duì)8種病原菌的抑菌效果見表1。由表1可知，DS－1對(duì)這幾種病原菌都有較好的抑制效果。其中DS－1對(duì)梨黑斑的抑菌效果最好達(dá)到90.57%，對(duì)其他病原菌的抑菌效果也達(dá)到了70%以上，效果顯著。

表1 DS－1對(duì)8種病原菌的抑制率Table 1 The inhibition rate of DS－1 to 8 pathogens

2.2 DS－1代謝物的抑菌效果

內(nèi)生細(xì)菌DS－1發(fā)酵液分別進(jìn)行高溫過濾處理后，濾液對(duì)病菌的抑制作用見表2。經(jīng)過濾處理的發(fā)酵液對(duì)8種病原菌都有一定的抑制效果，其中對(duì)梨黑斑菌最好，達(dá)到83.87%。而經(jīng)過高溫處理的代謝物對(duì)病原菌的抑制效果出現(xiàn)了明顯減弱，表明菌株產(chǎn)生的代謝物中主要是對(duì)高溫敏感的一些蛋白類物質(zhì)。

3 討論與結(jié)論

在丹參葉片中分離到的這株DS－1細(xì)菌對(duì)梨黑斑病菌、番茄早疫病菌、小麥赤霉病菌等8種病原真菌均出現(xiàn)不同程度的抑制作用，總體上抑制作用表現(xiàn)較強(qiáng)，抑制率均超過了70%。在對(duì)其發(fā)酵液的研究中，發(fā)酵液經(jīng)過濾膜過濾處理后仍對(duì)8種病原菌有較好的抑制率，但不如DS－1細(xì)菌的抑制效果，推測(cè)內(nèi)生細(xì)菌產(chǎn)生的抑菌活性物質(zhì)可能部分存在于菌絲體內(nèi)，需要進(jìn)一步對(duì)菌絲體進(jìn)行研究；高溫高壓處理的發(fā)酵液對(duì)病原菌的抑制率卻明顯下降，這表明DS－1產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物對(duì)高溫敏感，推測(cè)有可能是蛋白類物質(zhì)，它們往往對(duì)高溫是極其敏感的。鑒于以上對(duì)DS－1的初步研究，DS－1是一株有生防潛力的內(nèi)生細(xì)菌，應(yīng)對(duì)其進(jìn)行深入研究。

為了對(duì)DS－1進(jìn)行深入的研究，有待對(duì)其發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化以及對(duì)其代謝產(chǎn)物的成分進(jìn)行分析研究，并對(duì)DS－1進(jìn)行鑒定，為以后工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

表2 DS－1代謝物的抑菌效果Table 2 The antibacterial effect of DS－1

［1］劉志俊，段渝峰.生物農(nóng)藥新概念新發(fā)展［J］.農(nóng)藥科學(xué)與管理，2003，24（7）：28－32.

［2］易自力，周樸華，朱雅安.植物抗真菌病害基因工程研究進(jìn)展［J］.作物研究，2001（3）：81－84.

［3］肖愛萍，李庚花，游春萍，等.5株拮抗細(xì)菌對(duì)香蕉枯萎病菌的抑制作用［J］.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，27（4）：572－575.

［4］馬紅娟，楊秀娟，阮宏椿，等.拮抗細(xì)菌對(duì)香蕉枯萎病菌的離體抑菌活性研究［J］.福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2008，23（3）：251－254.

［5］Li Q Q，Luo K，Lin W，etal.Isolation of to mato endophytic antagonists againts Ralstonia sol anacear u m（in Chinese）［J］.Acat Phytopat hologica Sinica，2003，33（4）：364－367.

［6］司美茹，薛泉宏，余博，等.36株生防菌對(duì)辣椒疫病等4種病原真菌的拮抗作用研究［J］.西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2005，33（1）：49－53.

［7］張琴芳，代光輝，顧振芳，等.非致病性鐮刀菌Fusariu m oxyspor u m菌株47（FO47）對(duì)番茄枯萎病的防治效果［J］.上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)（農(nóng)業(yè)科學(xué)版），2004，22（1）：17－21.

［8］孔慶科，丁愛云.內(nèi)生細(xì)菌作為生防因子的研究進(jìn)展［J］.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2001，32（2）：256－260.

［9］楊海蓮，孫曉璐，宋未.植物內(nèi)生細(xì)菌的研究［J］.微生物學(xué)通報(bào)，1998，25（4）：224－226.

［10］楊海蓮，孫曉璐，宋未，等.植物根際促生細(xì)菌和內(nèi)生細(xì)菌的誘導(dǎo)抗病性的研究進(jìn)展［J］.植物病理學(xué)報(bào)，2000，30（2）：106－109.

［11］Wu J Y，Ng J，Shi M，Wu S J.Enhanced secondar y metabolite（tanshinone）production of Salvia miltiorr hiza hairy r oots in a novel rootbacteria coculture process［J］.Applied Micr obiology and Biotechnology，2007，77（3）：543－550.

［12］Wang J W，Wu J Y.Tanshinone biosynthesis in Salvia miltiorr hiza and production in plant tissue cultures［J］.Applied Microbiology and Biotechnology，2010，88（2）：437－449.

［13］王研，溫新寶，秦翠萍，等.丹參提取物體外抗氧化活性研究［J］.西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2011，20（11）：160－163.

［14］張逸，褚會(huì)娟，張今今.秦巴山區(qū)丹參居群遺傳與表觀遺傳多樣性比較［J］.西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào).2012，21（10）：142－148.

［15］戴水蓮，林警，高麗，等.PDA培養(yǎng)基中加入青霉素、鏈霉素的抗菌作用試驗(yàn)簡(jiǎn)報(bào)［J］.中國(guó)食用菌，2007，26（4）：53－54.