黃海東，康景佳，尹 祿，管 迪，張 欣，李泓甫

（武警遼寧省總隊(duì)醫(yī)院眼科，遼寧 沈陽(yáng) 110034）

角膜基質(zhì)細(xì)胞（corneal stromal fibroblasts）作為角膜基質(zhì)的重要細(xì)胞成分之一，是角膜維持透明性的關(guān)鍵因素，在角膜基質(zhì)代謝中起重要作用。角膜發(fā)生潰瘍時(shí)，角膜基質(zhì)細(xì)胞活化，變形，進(jìn)而纖維化，成為角膜成纖維細(xì)胞的主要來(lái)源，參與組成角膜防御系統(tǒng)［1，2］。cyclinD1是細(xì)胞增生內(nèi)源性調(diào)控系統(tǒng)的主要組成部分，在G1期啟動(dòng)，調(diào)控G1～S期過(guò)程，是細(xì)胞增生調(diào)控的主要增生信號(hào)［3，4］。本研究觀(guān)察反義cyclinD1基因轉(zhuǎn)染對(duì)人角膜基質(zhì)細(xì)胞增生的影響效果，旨在為眼科疾病的基因治療提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)所用的人角膜組織均在沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院眼庫(kù)獲得。將人角膜組織裁剪成塊后進(jìn)行原代細(xì)胞培養(yǎng)以獲得人角膜基質(zhì)細(xì)胞。通過(guò)胰蛋白酶消化法按照1∶2傳代獲得處于生長(zhǎng)期的第2代人角膜基質(zhì)細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑及儀器 美國(guó)Gibco公司生產(chǎn)的陽(yáng)離子脂質(zhì)體lipofectamine；北京大學(xué)第一醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室存有的反義cyclinD1基因；美國(guó)Maxim公司研發(fā)的鼠抗人／兔cyclinD1單克隆抗體工作液以及兔抗鼠SP免疫組織化學(xué)試劑盒；美國(guó)Sigma公司生產(chǎn)的MTT（四甲基偶氮唑鹽）；北京昌化精細(xì)化工廠(chǎng)制造的DMSO（二甲基亞砜）；美國(guó)NAPCO公司生產(chǎn)的CO2恒溫培養(yǎng)箱；日本Olympus公司制造的生物顯微鏡；香港悅泰洋行銷(xiāo)售的酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)方法 細(xì)胞計(jì)板制備角膜基質(zhì)單細(xì)胞懸液共2×105／mL，取2ml在3個(gè)內(nèi)置蓋玻片的6孔板內(nèi)進(jìn)行接種，3個(gè)板分別對(duì)應(yīng)3組。以無(wú)血清DMEM液對(duì)1μl的反義cyclinD1質(zhì)?；?μl的 PBS至100μl，稀釋 4μl的 Lipofectamine 或 4μl的 PBS 至100μl，輕混稀釋液，室溫下進(jìn)行孵育（30min），加入無(wú)血清培養(yǎng)液0.8ml，緩慢加入轉(zhuǎn)染準(zhǔn)備細(xì)胞中（細(xì)胞80%融合，無(wú)血清DMEM沖洗），放置在CO2恒溫培養(yǎng)箱（37度）24小時(shí)，除掉轉(zhuǎn)染液，加入DMEM培養(yǎng)液（含20% 的FBS）進(jìn)行培養(yǎng)，每日換培養(yǎng)液。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。終止轉(zhuǎn)染后第2、6、10d，在3個(gè)板中取細(xì)胞爬片，冷丙酮固定后PBS沖洗，加入鼠抗人／兔cyclinD1單克隆抗體（比例為1∶100），4℃下放置1夜，加入經(jīng)過(guò)生物素標(biāo)記處理的兔抗鼠二抗（1∶200），返藍(lán)，脫水，透明，封片及攝片處理后，生物顯微鏡下進(jìn)行觀(guān)察cyclinD1蛋白表達(dá)。

1.3 評(píng)價(jià)指標(biāo) 免疫細(xì)胞化學(xué)法記錄轉(zhuǎn)染后cyclinD1蛋白表達(dá)情況。0.5%錐蟲(chóng)藍(lán)染色法分析細(xì)胞活性。生物顯微鏡下細(xì)胞核顯示為棕褐色著染陽(yáng)性。用Combridge Quantimete 970型圖像分析儀以及Quips軟件編制測(cè)量cyclinD1陽(yáng)性信號(hào)程序。生物顯微鏡攝取細(xì)胞圖像，中央處理器進(jìn)行細(xì)胞樣本掃描、轉(zhuǎn)換及測(cè)量細(xì)胞陽(yáng)性信號(hào)吸光度值（A值）。MTT法檢測(cè)測(cè)定570nm下每孔吸光度值（A570值）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理，計(jì)數(shù)資料用表示，各組樣本均數(shù)采用方差齊性檢驗(yàn)，不同時(shí)點(diǎn)的A值及A570值用單因素方差分析，組間比較采用LSD－t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后cyclinD1蛋白表達(dá)情況 對(duì)照1組和對(duì)照2組提示多數(shù)細(xì)胞核cyclinD1染色呈陽(yáng)性，實(shí)驗(yàn)組僅有少量細(xì)胞核cyclinD1染色呈陽(yáng)性，見(jiàn)圖1、2。轉(zhuǎn)染后，對(duì)照1組與對(duì)照2組A值略有下降，但兩組間無(wú)顯著差異（P＞0.05）。實(shí)驗(yàn)組A值下降明顯，與對(duì)照1、2組比較，差異有顯著性，見(jiàn)表1。

圖1 對(duì)照1組轉(zhuǎn)染后，大量細(xì)胞核cyclinD1量細(xì)胞核cyclinD1染色呈陽(yáng)性Figure 1 Large amount of positive dyeing of cyclinD1in nucleus in control group 1

圖2 反義cyclinD1轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染后，少 染色呈陽(yáng)性Figure 2 Few positive dyeing of cyclinD1in nucleus after antisense cyclinD1transfection

表1 不同時(shí)間點(diǎn)各組轉(zhuǎn)染后cyclinD1表達(dá)情況（）Table 1 The comparison on cyclinD1expression after gene transfection for different time

表1 不同時(shí)間點(diǎn)各組轉(zhuǎn)染后cyclinD1表達(dá)情況（）Table 1 The comparison on cyclinD1expression after gene transfection for different time

組別2d 6d 10d對(duì)照1組658.29±29.37645.97±36.18662.87±31.65對(duì)照2組 678.34±42.41650.83±60.42625.76±54.64實(shí)驗(yàn)組 426.32±56.39438.36±63.25454.27±71.18 F 15.397 12.937 9.254 P 0.023 0.021 0.037

2.2 反義cyclinD1轉(zhuǎn)染后人角膜基質(zhì)細(xì)胞增生的改變 反義cyclinD1轉(zhuǎn)染后，A570值顯著低于未進(jìn)行反義cyclinD1轉(zhuǎn)染的對(duì)照1組和對(duì)照2組，差異有顯著性（P＜0.05），提示反義cyclinD1具有抑制人角膜基質(zhì)細(xì)胞增生的作用。對(duì)照1組與對(duì)照2組間A570值無(wú)顯著性差異（P＞0.05），提示lipofectamine對(duì)人角膜基質(zhì)細(xì)胞增生無(wú)顯著作用，見(jiàn)表2。

表2 不同時(shí)間點(diǎn)各組轉(zhuǎn)染后A570值比較（）Table 2 The comparison on A570values after gene transfection for different time

表2 不同時(shí)間點(diǎn)各組轉(zhuǎn)染后A570值比較（）Table 2 The comparison on A570values after gene transfection for different time

組別2d 6d 10d對(duì)照1組0.583±0.0360.451±0.0390.429±0.031對(duì)照2組 0.549±0.0510.421±0.0870.403±0.028實(shí)驗(yàn)組 0.392±0.0470.294±0.0340.291±0.031 F 16.387 13.856 10.349 P 0.021 0.027 0.038

3 討論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)體外培養(yǎng)原代細(xì)胞獲取人角膜基質(zhì)細(xì)胞，通過(guò)免疫組織化學(xué)法以及MTT法檢測(cè)，生物顯微鏡攝取cyclinD1著染圖像，計(jì)算機(jī)圖像處理系統(tǒng)分析，觀(guān)察反義cyclinD1轉(zhuǎn)染后，人角膜基質(zhì)細(xì)胞增生情況的變化。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染后2、6、10d，反義cyclinD1轉(zhuǎn)染組A值以及A570值降低明顯，與其他兩組比較，差異有顯著性（P＜0.05）。但觀(guān)察時(shí)間延長(zhǎng)，相關(guān)數(shù)值有所回升，提示陽(yáng)離子脂質(zhì)體能夠介導(dǎo)人角膜基質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行反義cyclinD1轉(zhuǎn)染，外源基因表達(dá)具有時(shí)間限制，不能與宿主細(xì)胞基因組進(jìn)行整合，能夠滿(mǎn)足手術(shù)或創(chuàng)傷后進(jìn)行抑制基質(zhì)細(xì)胞增生的需求。MTT法檢測(cè)提示陽(yáng)反義cyclinD1基因轉(zhuǎn)染能夠?qū)θ私悄せ|(zhì)細(xì)胞增生進(jìn)行抑制，而陽(yáng)離子脂質(zhì)體對(duì)細(xì)胞增生不具有影響作用。Motkura等在1991年首次在甲狀旁腺腺瘤中克隆和鑒定出cyclinD1基因［5］。cyclinD1基因位于11q13染色體上，基因編碼區(qū)含有高含量GC，末端含有1個(gè)Poly－A區(qū)（由69個(gè)腺苷酸殘基組成），全長(zhǎng)120kb，有5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子組成，編碼蛋白共有295個(gè)氨基酸殘基，第56～141位氨基酸序列稱(chēng)Cyclinbox，為保守序列［6］。cyclin D1是G1期細(xì)胞的細(xì)胞周期素，能夠調(diào)控G1／S轉(zhuǎn)換，目前相關(guān)研究已經(jīng)證實(shí)cyclinD1協(xié)同Rb基因，控制CyclinD1－CDK4復(fù)合物形成，共同對(duì)G1期進(jìn)程進(jìn)行調(diào)控［7］。CyclinD1是已知的重要細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有密切關(guān)聯(lián)［8～10］，而隨著研究的不斷深入以及基因治療在眼科治療的新思路，反義基因轉(zhuǎn)染技術(shù)進(jìn)行抑制細(xì)胞增生的研究逐漸成為臨床研究的熱點(diǎn)［11，12］。本實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)了反義cyclinD1基因轉(zhuǎn)染能夠抑制細(xì)胞增生，但是關(guān)于人角膜基質(zhì)細(xì)胞反義cyclinD1基因轉(zhuǎn)染后，RNA水平上的cyclinD1變化仍需進(jìn)一步探討和揭示。

4 結(jié)論

反義cyclinD1基因轉(zhuǎn)染，一定時(shí)間內(nèi)降低cyclinD1表達(dá)，抑制人角膜基質(zhì)細(xì)胞增生，是角膜過(guò)度愈合反應(yīng)的基因治療的基礎(chǔ)。

［1］Jung KH，Kim JK，Noh JH，et al.Targeted disruption of nemolike kinase inhibits tumor cell growth by simultaneous suppression of cyclinD1and CDK2in human hepatocellular carcinoma［J］.J Cell Biochem，2010，110（3）：687－696.

［2］Abdelkader A，El－Sayed ME，Kaufman HE.Confocal microscopy of corneal wound healing after deep lamellar keratoplasty in rabbits［J］.Arch Ophthalmol，2010，128（1）：75－80.

［3］Lange C，HuttnerWB，Calegari F.Cdk4／cyclinD1over expression in neural stem cells shortens G1，delays neurogenesis，and promotes the generation and expansion of basal progenitor［J］.Cell Stem Cell，2009，5（3）：320－331.

［4］Hartwell LH，Weinert TA.Checkpoints：controls that ensure the order of cell cycle events［J］.Science，2009，246（4930）：629－634.

［5］李永昊，肖玉周，汪萬(wàn)英，等.CyclinD1、CDK4、P16在骨肉瘤中的表達(dá)及臨床意義［J］.中華全科醫(yī)學(xué)，2012，10（2）：191－192.

［6］Dilek F H，Topak N，Tokyol C，et al.β－Catenin and its relation to VEGF and cyclinD1expression in pT3rectosigmoid cancers［J］.Turk J Gastroenterol，2010，21（4）：365－371.

［7］梁彩霞，吳 華.Hath1、P27和CyclinD1基因在惡性腫瘤中的表達(dá)及相關(guān)性研究［J］.中國(guó)醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，2013，10（14）：150－152.

［8］楊萍麗，彭心宇，劉戈然，等.cyclinD1、p27和ki－67在鼻咽鱗癌組織中的表達(dá)及意義［J］.現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2012，20（6）：1158－1160.

［9］李啟炯，宋軍民，陸 敏，等.CyclinD1在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)及與肝細(xì)胞癌患者預(yù)后的關(guān)系［J］.中華臨床醫(yī)師雜志（電子版），2012，6（2）：356－360.

［10］高 涵，于建憲.胃癌組織中CyclinD1與P27蛋白表達(dá)及其意義［J］.齊魯醫(yī)學(xué)雜志，2012，23（3）：231－232.

［11］高麗昌，李婷婷，李富勇，等.ERK1／2信號(hào)通路在角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子－2誘導(dǎo)角膜基質(zhì)細(xì)胞增值中的作用［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2011，27（10）：1405－1408.

［12］榮 蓓，晏曉明.反義cyclinD1基因轉(zhuǎn)染對(duì)人角膜基質(zhì)細(xì)胞增生的影響［J］.眼科研究，2010，28（11）：1025－1027.