張 莉，范賢明，王文軍，李 坑，向旭東

（1.瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)二科，四川 瀘州 646000）；2.中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院急診科，湖南 長沙 410011）

支氣管哮喘（簡稱哮喘）是一種與免疫功能紊亂有關(guān)的慢性氣道炎癥性疾病，其中T細(xì)胞發(fā)揮著重要作用［1］。Th17細(xì)胞是一類新的T細(xì)胞亞群，主要通過分泌IL－17起作用。Th17／IL－17參與了多種炎癥與自身免疫性疾?。?］。近期研究發(fā)現(xiàn)，Th17／IL－17可能在哮喘的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要角色［3，4］。中醫(yī)實踐表明，三氧化二砷（Arsenic trioxide，ATO）具有良好的平喘作用，但機制不清楚，且關(guān)于ATO對哮喘Th17／IL－17的作用亦未見報道。本研究通過建立哮喘小鼠模型，觀察ATO對哮喘小鼠的作用，尤其是對Th17細(xì)胞和IL－17的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 卵白蛋白（OVA，V級）、氫氧化鋁凝膠、ATO（美國Sigma公司）；淋巴細(xì)胞分離液（中國達(dá)科為生物技術(shù)有限公司）；T細(xì)胞磁珠分離試劑盒、LS分離柱、Midi MACS磁珠分選器（德國 Milte－nyi公司）；FITC抗鼠IL－17A、固定劑、破膜劑（美國Biolegend公 司）；IL－4、IL－17ELISA 試 劑 盒 （美 國R＆D公司）。

1.2 動物分組及模型復(fù)制 30只SPF級雌性BALB／c小鼠，6～8周齡，體重（18～22）g，隨機分為對照組、哮喘組、ATO組，每組10只。哮喘組及ATO組于第1、13天腹腔注射致敏劑0.2ml（含OVA 10 μg和氫氧化鋁凝膠2mg），19天起以5%OVA霧化激發(fā)，每天30min，連續(xù)6天。ATO組每次激發(fā)前30 min腹腔注射2.5mg／kg ATO 0.2ml，哮喘組以等量PBS代替。對照組致敏激發(fā)用PBS代替。

1.3 小鼠處理及標(biāo)本制備 末次激發(fā)24小時后，Buxco系統(tǒng)測量氣道對乙酰甲膽堿（Mch）的肺阻力。收集左肺支氣管肺泡灌洗液（BALF），細(xì)胞瑞士染色后分類計數(shù)。碾磨脾臟，淋巴細(xì)胞分離液制備脾單個核細(xì)胞懸液，免疫磁珠陽性分選T細(xì)胞。

1.6 ELISA檢測細(xì)胞因子濃度 BALF及培養(yǎng)上清液中IL－17、IL－4測定采用ELISA法，參照試劑盒說明操作。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，數(shù)據(jù)以表示，采用單因素方差分析或獨立樣本t檢驗。簡單直線相關(guān)性分析探討兩因素之間相關(guān)關(guān)系。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BALF中細(xì)胞計數(shù)及分類 與對照組相比，哮喘組BALF中白細(xì)胞總數(shù)、嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞顯著增加（均P＜0.01）；與哮喘組相比，ATO組上述細(xì)胞數(shù)顯著減少（均P＜0.05），見表1。

2.2 肺阻力檢測 與對照組相比，哮喘組隨著 Mch劑量遞增表現(xiàn)出更顯著的氣道阻力；ATO組氣道阻力顯著低于哮喘組，見圖1。

表1 各組BALF中白細(xì)胞總數(shù)和分類計數(shù)（×104／ml，n＝6，）Table 1 Classification and counting of white blood cell in BALF

表1 各組BALF中白細(xì)胞總數(shù)和分類計數(shù)（×104／ml，n＝6，）Table 1 Classification and counting of white blood cell in BALF

注：與對照組比較，①P＜0.01；與哮喘組比較，②P＜0.05

組別 細(xì)胞總數(shù) 嗜酸性粒細(xì)胞 淋巴細(xì)胞 中性粒細(xì)胞對照組 6.95±1.220.15±0.060.36±0.190.23±0.09哮喘組 21.11±3.28① 3.10±0.50① 6.60±0.97① 4.92±0.45①ATO組 13.04±2.58② 1.06±0.19② 2.43±0.28② 2.36±0.29②

圖1 各組氣道肺阻力比較Figure 1 Comparison of lung resistance in each group

2.3 Th17細(xì)胞陽性率比較 哮喘組脾臟Th17細(xì)胞陽性率［（12.2±2.2）%］顯著高于對照組［（1.4±0.4）%，P＜0.01］；ATO組Th17細(xì)胞陽性率［（8.9±1.2）%］顯著低于哮喘組（P＜0.01），見圖2。

圖2 各組脾臟Th17細(xì)胞陽性率比較Figure 2 Comparison of positive rate of Th17cells

表2 各組脾臟T細(xì)胞總數(shù)及BALF相關(guān)指標(biāo)比較（n＝6，）Table 2 and IL－17and IL－4in BALF

表2 各組脾臟T細(xì)胞總數(shù)及BALF相關(guān)指標(biāo)比較（n＝6，）Table 2 and IL－17and IL－4in BALF

注：與對照組比較，①P＜0.05；與哮喘組比較，②P＜0.05

組別 CD4＋T細(xì)胞（×108／L） IL－17（pg／ml） IL－4（pg／ml）對照組 6.9±0.8 97.6± 7.6 185.6±21.5哮喘組 17.9±2.1① 169.5± 8.3① 323.5±16.9①ATO組 12.9±2.3② 113.9±11.0② 248.3±19.0②

2.5 培養(yǎng)上清液中IL－17、IL－4濃度 ATO 干預(yù)組培養(yǎng)上清液中IL－17、IL－4濃度［分別為（7.9±1.5）、（42.7±5.0）pg／ml］均顯著低于哮喘原液組［分別為（15.3±2.4）、（71.6±7.0）pg／ml，均P＜0.01］。

2.6 相關(guān)性分析 Th17細(xì)胞陽性率與BALF中性粒細(xì)胞數(shù)量呈顯著正相關(guān)（r＝0.998，P＜0.05），BLAF中IL－17濃度與中性粒細(xì)胞數(shù)呈顯著正相關(guān)（r＝0.982，P＜0.05）。

3 討論

經(jīng)典的“Th1／Th2失衡理論”并不能解釋哮喘的全部：過繼回輸Th1細(xì)胞可以引起嚴(yán)重的氣道炎癥，Th1型細(xì)胞因子IFN－γ與抗原誘導(dǎo)的氣道高反應(yīng)性和嗜酸粒細(xì)胞浸潤有關(guān)。近期支氣管黏膜活檢發(fā)現(xiàn)，重癥哮喘患者氣道Th17細(xì)胞數(shù)量及其分泌IL－17的功能明顯增加［3］。Th17／IL－17對中性粒細(xì)胞具有強大的趨化作用，可導(dǎo)致氣道局部炎癥擴大或持久存在，介導(dǎo)激素抵抗型哮喘的氣道炎癥和高反應(yīng)性［4］。Th17、IL－17是介導(dǎo)哮喘免疫源性氣道炎癥的重要原因［5］。

既往研究認(rèn)為，小劑量ATO能促進(jìn)嗜酸粒細(xì)胞凋亡、抑制NF－κB表達(dá)；能抑制骨髓嗜酸性粒細(xì)胞生成，降低血清和BALF中IL－5水平。但是關(guān)于ATO對哮喘T細(xì)胞，尤其是Th17、IL－17的研究未見報道。Th17細(xì)胞能通過IL－17介導(dǎo)氣道中性粒細(xì)胞聚集，并可誘導(dǎo)Th2細(xì)胞介導(dǎo)的嗜酸性粒細(xì)胞炎癥［6］。可見與嗜酸性粒細(xì)胞相比，Th17細(xì)胞處于炎癥反應(yīng)上游，對其進(jìn)行探討更有意義。本實驗中，ATO干預(yù)組小鼠BALF中各類炎癥細(xì)胞及氣道肺阻力顯著低于哮喘組，提示ATO能減輕氣道炎癥及高反應(yīng)性。Th2細(xì)胞主要通過分泌IL－4等Th2型因子誘導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞浸潤參與哮喘發(fā)病［5］。我們發(fā)現(xiàn)，ATO組BALF中嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量及IL－4含量均較哮喘組明顯下降；體外實驗同樣顯示T細(xì)胞在ATO干預(yù)后分泌IL－4顯著減少，提示ATO能夠抑制Th2細(xì)胞的功能，減輕氣道嗜酸性粒細(xì)胞性炎癥。

部分哮喘患者對糖皮質(zhì)激素治療不敏感與氣道中性粒細(xì)胞性炎癥有關(guān)，因為糖皮質(zhì)激素可對抗中性粒細(xì)胞凋亡［7］。本研究提示ATO能減輕氣道中性粒細(xì)胞性炎癥反應(yīng)。ATO組Th17細(xì)胞陽性率、BLAF中IL－17含量均較哮喘組下降，體外實驗也證實ATO能抑制T細(xì)胞分泌IL－17，提示ATO能抑制Th17、IL－17的表達(dá)。Th17／IL－17是介導(dǎo)哮喘氣道中性粒細(xì)胞性炎癥的重要原因［5］。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，Th17細(xì)胞陽性率、IL－17水平均與BALF中性粒細(xì)胞數(shù)量呈顯著正相關(guān)，故我們推測ATO對哮喘的治療作用除降低Th2效應(yīng)外，還可能與減少Th17、IL－17產(chǎn)生，從而抑制中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的氣道炎癥及高反應(yīng)性有關(guān)。

4 結(jié)論

ATO能夠抑制Th17及IL－17的表達(dá)，減輕哮喘小鼠氣道炎癥反應(yīng)及高反應(yīng)性。ATO可能對治療糖皮質(zhì)激素不敏感的中性粒細(xì)胞性哮喘有潛在價值。

［2］Xie Y，Chen R，Zhang X，et al.Blockade of interleukin－17Aprotects against coxsackievirus B3－induced myocarditis by increasing COX－2／PGE2production in the heart［J］.FEMS Immunol Med Microbiol，2012，64：343－351.

［3］Pène j，Chevalier S，Preisser L，et al.Chronically inflamed human tissues are infiltrated by highly differentiated Th17lymphocytes［J］.J Immunol，2008，180：7423－7430.

［4］Vazquez－Tello A，Halwani R，Hamid Q，et al.Glucocorticoid receptor－beta up－regulation and steroid resistance induction by IL－17and IL－23cytokine stimulation in peripheral mononuclear cells［J］.J Clin Immunol，2013，33：466－478.

［5］Cosmi L，Liotta F，Maggi E，et al.Th17cells：new players in asthma pathogenesis［J］.Allergy，2011，66：989－998.

［6］Wakashin H，Hirose K，Maezawa Y，et al.IL－23and Th17cells enhance Th2－cell－mediated eosinophilic airway inflammation in mice［J］.Am J Respir Crit Care Med，2008，178：1023－1032.

［7］Zijlstra GJ，Ten Hacken NH，Hoffmann RF，et al.Interleukin－17Ainduces glucocorticoid insensitivity in human bronchial epithelial cells［J］.Eur Respir J，2012，39：439－445.