符 輝，吳奇輝，王廣蘭，王 娟，劉 瑩，黃 文*

1華中農(nóng)業(yè)大學(xué)體育課部;2華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，武漢430070;3武漢體育學(xué)院健康科學(xué)學(xué)院，武漢 430079

茯苓為多孔菌科真菌屬茯苓(Poria cocos(Schw.)Wolf)的干燥菌核，具有利水滲濕、健脾寧心等功效，為中藥“四君八珍”之一［1］。但是，占茯苓菌核干重93%的β-茯苓聚糖(β-pachymose)不溶于水且生理活性較弱，不利于臨床應(yīng)用。β-茯苓聚糖在堿性條件下與氯乙酸反應(yīng)生成一種水溶性多糖，即羧甲基茯苓多糖(Carboxymethyl-pachyman，CMP)，具有抗腫瘤、增強(qiáng)免疫力、抗衰老、預(yù)防結(jié)石等作用，可廣泛應(yīng)用于醫(yī)療保健領(lǐng)域［2，3］，但是至今還沒有對其抗疲勞研究的報(bào)道。本研究主要探討羧甲基茯苓多糖的抗運(yùn)動疲勞作用，挖掘茯苓多糖新的潛在生物功能，為開發(fā)新型、健康的抗運(yùn)動疲勞保健品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

茯苓菌塊:購于湖北羅田，由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)應(yīng)用真菌研究所鑒定為茯苓(Poria cocos)。

紅景天(含1%的紅景天苷):由湖北欣愷生物科技有限公司提供，并經(jīng)湖北省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院鑒定。

小白鼠:昆明種健康雄性小鼠(SPF級)，體質(zhì)量19±4 g，購于華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院。

CMP由本實(shí)驗(yàn)室制備，化學(xué)藥品均為國產(chǎn)分析純;乳酸測定試劑盒、尿素氮測定試劑盒、超氧化物歧化酶測定試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶測定試劑盒、乳酸脫氫酶測定試劑盒，均由南京建成生物工程研究所提供。

1.2 儀器與設(shè)備

WG2003型電熱鼓風(fēng)干燥箱:天津市泰斯特儀器有限公司;SHZ-C型循環(huán)水式真空泵:鞏義市予華儀器有限公司;722紫外可見分光光度計(jì):上海光譜儀器有限公司;HH-S2型數(shù)顯恒溫水浴鍋:金壇市醫(yī)療儀器廠;Avanti J-E型冷凍離心機(jī)美國BECKMAN公司。

1.3 方法

1.3.1 羧甲基茯苓多糖(CMP)的制備

將茯苓菌塊用粉碎機(jī)粉碎，過100目，稱取10 g茯苓粉置于三口燒瓶中。然后加入50 mL 85%乙醇于55℃下攪拌溶脹30 min。之后加入3.4 g氫氧化鈉，堿化1 h。一小時(shí)之后再加入9.25 g氯乙酸及3.36 g氫氧化鈉反應(yīng)4 h。接著再加入3.36 g氫氧化鈉反應(yīng)3 h。取出，用乙酸中和至pH為6，用80%乙醇洗脫4次，與40℃下干燥5 h，得干燥小塊狀茯苓多糖，再將其用粉碎機(jī)粉碎，過100目，得干燥改性茯苓粉。然后，通過苯酚-硫酸法測得改性茯苓粉中羧甲基茯苓多糖(CMP)的含量為87.1%。

1.3.2 動物分組及給藥

將50只雄性小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為空白對照組(蒸餾水)、紅景天陽性對照組(1 g/kg)、羧甲基茯苓多糖低劑量組(35 mg/kg)、羧甲基茯苓多糖中劑量組(70 mg/kg)、羧甲基茯苓多糖高劑量組(140 mg/kg)，每組10只。各組均以10 mL/(kg/d)的劑量，1 次/d，連續(xù)灌胃30 d［4］。飼養(yǎng)溫度:18～22℃，濕度:50% ～60%。飼喂常規(guī)飼料，自由取食。

1.3.3 小鼠體質(zhì)量的測定

首次灌胃前稱量并記錄各組小鼠體質(zhì)量，末次灌胃之后游泳前稱量并記錄各組小鼠體質(zhì)量，計(jì)算各組小鼠體質(zhì)量的增加量。

1.3.4 小鼠負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)

末次灌胃后30 min，于尾部負(fù)重5%體質(zhì)量的鉛皮，在水深30 cm、水溫25℃的游泳箱中游泳，用秒表記錄小鼠自游泳開始至力竭的時(shí)間。當(dāng)小鼠頭部沉入水面10 s不能浮出，認(rèn)為達(dá)到力竭［5］。

1.3.5 小鼠血清尿素氮(BUN)和血乳酸(BLA)的測定

小鼠負(fù)重游泳至力竭，休息15 min之后，摘眼球取血，用南京建成試劑盒測定小鼠血清尿素氮(BUN)和血乳酸(BLA)的含量。

1.3.6 小鼠肝組織中超氧化物歧化酶(SOD)的測定

小鼠采血后立即取肝臟，用生理鹽水洗去殘留液，濾紙拭干，準(zhǔn)確稱取0.5 g肝組織，加9倍生理鹽水制成10%的組織勻漿。用南京建成試劑盒測定肝組織中超氧化物歧化酶(SOD)活性。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

采用SPSSl1.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 CMP對小鼠體重的影響

記錄第一次灌胃之前和最后一次灌胃30 min之后，各組小鼠負(fù)重游泳前的體質(zhì)量，統(tǒng)計(jì)灌胃期間各組小鼠體質(zhì)量增量。結(jié)果見表1。

表1 茯苓多糖對小鼠體質(zhì)量的影響(n=10，±s)Table 1 The effect of CMP on body weight of mice(n=10，±s)

表1 茯苓多糖對小鼠體質(zhì)量的影響(n=10，±s)Table 1 The effect of CMP on body weight of mice(n=10，±s)

組別Group對照組Control紅景天組Rhodiola低劑量組CMP-L中劑量組CMP-M高劑量組CMP-H體質(zhì)量增量 (g)Body weight(g) 9.22±1.99 9.44±2.11 9.54±2.25 9.87±1.84 9.77±1.85

由表1可知，與空白對照組相比，CMP高劑量組、中劑量組、低劑量組和紅景天組小鼠的體質(zhì)量增量沒有顯著性差異(P＞0.05)。

2.2 CMP對小鼠力竭游泳時(shí)間的影響

各組小鼠負(fù)重游泳致力竭，記錄并統(tǒng)計(jì)其負(fù)重力竭游泳時(shí)間。與空白對照組相比，紅景天組和3個(gè)CMP劑量組的小鼠負(fù)重力竭游泳時(shí)間明顯延長(P＜0.05)。結(jié)果見表2。

由表2可知，不同劑量組的CMP對小鼠負(fù)重力竭游泳時(shí)間具有不同程度的影響。低劑量組小鼠負(fù)重力竭游泳時(shí)間比空白對照組延長了51.01%(P＜0.05)，中劑量組小鼠負(fù)重力竭游泳時(shí)間比空白對照組延長了67.79%(P＜0.05);高劑量組小鼠負(fù)重力竭游泳時(shí)間比空白對照組延長了93.63%(P＜0.05)，具有明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系。

表2 CMP對小鼠負(fù)重力竭游泳時(shí)間的影響(n=10，±s)Table 2 The effect of CMP on weight loaded-swimming time of mice(n=10，±s)

表2 CMP對小鼠負(fù)重力竭游泳時(shí)間的影響(n=10，±s)Table 2 The effect of CMP on weight loaded-swimming time of mice(n=10，±s)

注:與空白對照組比較，*P ＜0.05。Note:Compare with control，*P ＜ 0.05.

組別Group對照組Control紅景天組Rhodiola低劑量組CMP-L中劑量組CMP-M高劑量組CMP-H游泳時(shí)間(s)Swimming time(s) 945.5±136.6 1584.3±115.41* 1427.8±218.6* 1586.5±203.1* 1830.8±117.7*延長率(%)Increase(%)-67.56 51.01 67.79 93.63

表3 CMP對小鼠運(yùn)動后血清尿素氮的影響(n=10，±s)Table 3 The effect of CMP on the levels of blood urea nitrogen of mice after exercise(n=10，±s)

表3 CMP對小鼠運(yùn)動后血清尿素氮的影響(n=10，±s)Table 3 The effect of CMP on the levels of blood urea nitrogen of mice after exercise(n=10，±s)

注:與空白對照組比較，*P ＜0.05。Note:Compare with control，*P ＜ 0.05.

組別Group對照組Control紅景天組Rhodiola低劑量組CMP-L中劑量組CMP-M高劑量組CMP-H血清尿素氮含量(mg/L)Blood urea nitrogen(mg/L) 85.76±3.62 73.14±3.19* 83.06±2.15 65.82±2.55* 61.92±3.17*清除率Clearance(%)-14.72 3.15 23.25 27.80

2.3 CMP對小鼠運(yùn)動后血清尿氮素的影響

各組小鼠負(fù)重游泳致力竭，休息15 min后摘眼球取血，測定并統(tǒng)計(jì)各組小鼠運(yùn)動后血清中尿素氮的含量。結(jié)果見表3。

由表3可知，與空白對照組相比，紅景天組和CMP中劑量組、高劑量組的小鼠血清尿素氮含量明顯降低(P＜0.05)。相對于空白對照組，CMP中劑量組的血清尿氮素清除率為23.25%(P＜0.05)，CMP高劑量組的血清尿氮素清除率為27.80%(P＜0.05)，具有一定的劑量效應(yīng)關(guān)系。

2.4 CMP對小鼠運(yùn)動后血乳酸的影響

各組小鼠負(fù)重游泳致力竭，休息15 min后摘眼球取血，測定并統(tǒng)計(jì)各組小鼠運(yùn)動后血清中乳酸的含量。結(jié)果見表4。

表4 CMP對小鼠運(yùn)動后血乳酸的影響(n=10，±s)Table 4 The effect of CMP on the levels of blood lactic acid of mice after exercise(n=10，±s)

表4 CMP對小鼠運(yùn)動后血乳酸的影響(n=10，±s)Table 4 The effect of CMP on the levels of blood lactic acid of mice after exercise(n=10，±s)

注:與空白對照組比較，*P ＜0.05。Note:Compare with control，*P ＜ 0.05.

組別Group對照組Control紅景天組Rhodiola低劑量組CMP-L中劑量組CMP-M高劑量組CMP-H血乳酸含量(mmol/L)blood lactic acid(mmol/L) 26.05±2.08 22.44±2.24* 23.68±2.66 18.69±1.21* 16.10±1.50*清除率Clearance(%)-13.86 9.10 28.25 38.20

由表4可知，與空白對照組相比，紅景天組和CMP中劑量組、高劑量組的小鼠血乳酸含量明顯降低(P＜0.05)。相對于空白對照組，CMP中劑量組的血乳酸清除率為28.25%(P＜0.05)，CMP高劑量組的血乳酸清除率為38.20%(P＜0.05)，具有明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系。

表5 CMP對小鼠運(yùn)動后肝組織中SOD的影響(n=10，±s)Table 5 The effect of CMP on the levels of SOD in liver of mice after exercise(n=10，±s)

表5 CMP對小鼠運(yùn)動后肝組織中SOD的影響(n=10，±s)Table 5 The effect of CMP on the levels of SOD in liver of mice after exercise(n=10，±s)

注:與空白對照組比較，*P ＜0.05。Note:Compare with control，*P ＜ 0.05.

組別Group對照組Control紅景天組Rhodiola低劑量組CMP-L中劑量組CMP-M高劑量組CMP-H SOD(u/mgpro) 202.66±13.08 281.76±12.24* 244.26±15.66 311.63±11.21* 353.73±14.50*提高率Increase(%)-39.03 19.54 53.77 74.56

2.5 CMP對小鼠運(yùn)動后肝組織中超氧化物歧化酶(SOD)影響

各組小鼠負(fù)重游泳致力竭，休息15 min后脫臼處死，取其肝臟，測定并統(tǒng)計(jì)各組小鼠運(yùn)動后肝組織中SOD的活性。結(jié)果見表5。

由表5可知，與空白對照組相比，紅景天組和CMP中劑量組、高劑量組的小鼠肝臟組織中SOD活性明顯升高(P＜0.05)。相對于空白對照組，CMP中劑量組的SOD活性提高率為53.77%(P＜0.05)，CMP高劑量組的 SOD活性提高率為74.56%(P＜0.05)，具有明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系。

3 討論

疲勞是機(jī)體一系列復(fù)雜的生理生化變化過程，是機(jī)體在一定環(huán)境條件下，由于長時(shí)間或過于繁重緊張的體力或腦力勞動而引起的工作效率暫時(shí)降低的一種生理心理現(xiàn)象，一般的檢測指標(biāo)是運(yùn)動耐力和生化指標(biāo)［6］。

疲勞最直接、最客觀的表現(xiàn)是運(yùn)動耐力的下降，游泳是全身消耗性運(yùn)動，劇烈的運(yùn)動消耗大量的能量，所以力竭游泳時(shí)間是反映運(yùn)動耐力的重要指標(biāo)，常用于評價(jià)體力疲勞。本研究通過小鼠負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)可知，與空白對照組相比，CMP低、中、高劑量組都可以可顯著提高小鼠的運(yùn)動耐力(P＜0.05)，提示CMP具有一定的抗疲勞作用。

評價(jià)體力疲勞的生化指標(biāo)中，血清尿氮素和血乳酸指標(biāo)的改變具有代表性，試驗(yàn)結(jié)果比較準(zhǔn)確，是檢測體力疲勞常用的生化指標(biāo)［7］。血清尿氮素含量的變化可以說明體內(nèi)含氮物質(zhì)的分解代謝情況，是評價(jià)機(jī)體在特殊條件下體力勞動負(fù)荷承受能力的一個(gè)較靈敏的指標(biāo)。機(jī)體對負(fù)荷的適應(yīng)力越差，則血液中產(chǎn)生的尿素氮就越多;反之，則產(chǎn)生的尿素氮就越少。

本研究結(jié)果表明，與空白對照組相比，CMP中、高劑量組的小鼠血清尿素氮含量明顯降低(P＜0.05)，提示CMP可以減慢小鼠體內(nèi)含氮物質(zhì)分解速度，有效改善機(jī)體對運(yùn)動負(fù)荷的壓力。長時(shí)間的運(yùn)動會導(dǎo)致機(jī)體相對缺氧、糖酵解加快，進(jìn)而產(chǎn)生大量的乳酸，使肌肉組織內(nèi)的pH值下降，最終導(dǎo)致疲勞，因此血乳酸水平也是反映機(jī)體疲勞程度的重要指標(biāo)［8］。乳酸在肌肉中堆積越多，疲勞的程度越嚴(yán)重。本研究結(jié)果表明，與空白對照組相比，CMP中、高劑量組的小鼠血乳酸含量明顯降低(P＜0.05)，提示CMP可以抑制運(yùn)動后乳酸的積累和生產(chǎn)，有利于減緩血乳酸的積累，從而減緩機(jī)體疲勞的發(fā)生，降低機(jī)體疲勞的程度。當(dāng)長時(shí)間運(yùn)動訓(xùn)練時(shí)，體內(nèi)氧化作用會大大加強(qiáng)，產(chǎn)生大量自由基，導(dǎo)致肌肉和肝臟中脂質(zhì)過氧化物增多，引起細(xì)胞或組織損傷，也是機(jī)體疲勞的原因［9］。本研究結(jié)果表明，與空白對照組相比，CMP中、高劑量組的小鼠肝臟組織SOD活性明顯提高(P＜0.05)，提示CMP具有抗自由基氧化的功能，阻止脂質(zhì)過氧化，進(jìn)而提高小鼠的運(yùn)動能力。

1 Li YL(李燕凌)，Zhang ZX(張志旭)，Hu L(胡令).Antioxidant of polysaccharides from Poria coco.Nat Prod Res Dev(天然產(chǎn)物研究與開發(fā))，2012，24:1126-1128.

2 Yan H，Xiao JZ，Yong L，et al.Novel biodegradable hydrogels based on pachyman and its derivatives for drug delivery.Int J Pharm，2009，37:89-98.

3 Lin Y，et al.Molecular mass and antitumor activities of sulfated derivatives of alpha-glucan from Poria cocos mycelia.Int J Biol Macromol，2004，34:289-294.

4 Ma L，et al.Anti-fatigue effects of salidroside in mice.J Med Col PLA，2008，23(2):88-93.

5 Jin FD，et al.Study on effect of jellyfish collagen hydrolysate on anti-fatigue and anti-oxidation.Food Hydrocolloids，2011，25:1350-1353.

6 Huang LZ，et al.Bioactivity-guided fractionation for anti-fatigue property of Acanthopanax senticosus．J Ethnopharmacol，2011，133:213-219.

7 You LJ，et al.In vitro antioxidant activity and in vivo anti-fatigue effect of loach(Misgurnus anguillicaudatus)peptides prepared by papain digestion.Food Chemistry，2011，124:188-194.

8 Wang J，et al.Anti-fatigue activity of the water-soluble polysaccharides isolated from Panax ginseng C.A.Meyer.J Ethnopharmacol，2010，130:421-423.

9 Tan W，et al.Anti-fatigue activity of polysaccharides extract from Radix Rehmanniae Preparata.Int J Biol Macromolecules，2012，50:59-62.