李會(huì)宣，楊 虹，張紅兵，高 健

1河北經(jīng)貿(mào)大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，石家莊050061;2華北制藥集團(tuán)新藥研究開發(fā)有限責(zé)任公司抗體藥物研制國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，石家莊 050015

姜黃素(Curcumin)是植物多酚類色素，廣泛存在于姜黃屬植物的根莖中，中藥姜黃的重要活性成分之一。姜黃素的主要藥理作用有抗氧化、抗炎、抗癌、降脂、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗纖維化、清除自由基等作用［1］。由于姜黃素?zé)o明顯的毒副作用，其抗腫瘤作用日益引起人們的重視，已成為腫瘤預(yù)防和治療的一個(gè)研究熱點(diǎn)［2］。姜黃素對(duì)于肝癌的作用，目前的研究多集中于體外抗腫瘤效應(yīng)［3］，對(duì)其分子機(jī)制報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)對(duì)姜黃素抑制人肝癌SMMC-7721細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)凋亡作用及其可能的作用機(jī)制進(jìn)行初步的研究。通過觀察姜黃素對(duì)人肝癌SMMC-7721細(xì)胞增殖和凋亡的影響，檢測(cè)姜黃素對(duì)SMMC-7721細(xì)胞中 Caspase-3、Survivin、Bcl-2 和 Bax基因表達(dá)的影響，揭示姜黃素誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的信號(hào)通路，以期為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

肝癌細(xì)胞SMMC-7721(華北制藥集團(tuán)新藥研究開發(fā)有限責(zé)任公司惠贈(zèng));姜黃素(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)以少量二甲基亞砜(DMSO)溶解配制成1 mmol/L儲(chǔ)備溶液;RPMI-1640(Gibico公司);MTT、胎牛血清、DMSO、ERK特異性抑制劑PD98059、p38 MAPK特異性抑制劑 SB203580及JNK特異性抑制劑SP600125購自Sigma公司;Trizol試劑及RT-PCR反應(yīng)體系購自Promega公司;Survivin、Bcl-2和Bax的PCR引物由上海生物工程有限責(zé)任公司合成;鼠抗人 Caspase 3、Survivin、Bcl-2、Bax、β-actin、p-JNK/JNK、p-ERK/ERK 和 p-p38/p38的單克隆抗體，HRP聯(lián)連的兔抗鼠的二抗、化學(xué)發(fā)光試劑均為Santa Cruz公司產(chǎn)品。

1.2 儀器與設(shè)備

垂直電泳系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)，流式細(xì)胞儀(BD FACSCalibur)，Gel DOC2000凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)，Microplate Reader 450酶標(biāo)儀(美國Bio-Rad公司)，5415D離心機(jī)(基因科技公司)，半干轉(zhuǎn)膜儀(美國Bio-Rad公司)和ID數(shù)碼成像分析系統(tǒng)(美國Kodak公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 MTT法測(cè)定姜黃素對(duì)SMCC-7721細(xì)胞增殖的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SMCC-7721細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化分離，重新混懸于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為5×104cell/mL，以每孔200 μL加入96孔培養(yǎng)板中于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，貼壁24 h后分別加入終濃度為10、20、40和80 μmol/L的姜黃素，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，并設(shè)陰性和空白對(duì)照組，分別培養(yǎng) 12、24、48、72 h，每孔分別加入5 mg/mL MTT溶液40μL，振蕩后于37.0℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸棄孔內(nèi)上清培養(yǎng)液，于每孔內(nèi)加入300 μL DMSO，使形成的甲月贊(ormazan)充分溶解，放入酶標(biāo)儀，選擇570 nm，空白孔調(diào)零，記錄各孔吸光度OD值。

1.3.2 細(xì)胞計(jì)數(shù)法測(cè)定姜黃素對(duì)SMCC-7721細(xì)胞增殖的影響

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SMCC-7721細(xì)胞懸液以3×104～4×104cell/孔的密度接種于24孔板，培養(yǎng)12 h后，吸去培養(yǎng)液，隨機(jī)分組(n=5)，加入正常培養(yǎng)液(不加姜黃素的Control組)或終濃度為10、20、40和80 μmol/L的姜黃素的培養(yǎng)液，培養(yǎng)一定時(shí)間后，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，以時(shí)間為橫軸、細(xì)胞數(shù)為縱軸做量效曲線。

1.3.3 流式細(xì)胞儀(FCM)檢測(cè)姜黃素誘導(dǎo)SMMC-7721細(xì)胞的凋亡

人肝癌SMMC-7721細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，換無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)12 h使細(xì)胞周期同步化，加入終濃度為40 μmol/L的姜黃素溶液培養(yǎng)，正常對(duì)照Control組加入等量培養(yǎng)基，再培養(yǎng)48 h后，制成單細(xì)胞懸液，離心棄上清，沿管壁緩慢加入700 mL/L預(yù)冷(-20℃)乙醇固定，上機(jī)檢測(cè)前RNA酶消化，再加入PI染色液，4℃避光30 min，F(xiàn)CM檢測(cè)凋亡率及細(xì)胞周期。

1.3.4 RT-PCR檢測(cè) Survivin、Bcl-2和 Bax的 mRNA的表達(dá)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SMMC-7721細(xì)胞，加入40 μmol/L的姜黃素作用不同后采用Trizol一步法提取總RNA，取 1 μL 總 RNA 以 10 μL 體系逆轉(zhuǎn)錄，制備cDNA并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR。使用引物如下:Survivin(GenBank:U75285.1)上游引物5'-CCACCGCATCTCTACATTC-3'，下游引物 5'-CTTTC TTCGCAGTTTCCTC-3'，產(chǎn)物長(zhǎng)度 344 bp;Bcl-2(Gen-Bank:M13995.1)上游引物5'-ATGGCGCACGCTGGGAGAA-3'，下 游 引 物 5'-CGGTAGCGGCGGGAGAAGTC-3'，產(chǎn)物長(zhǎng)度 326bp;Bax(GenBank:AY217036.1)上游引物5'-ACCAAGAAGCTGAGCGAGTGTC-3'，下游引物 5'-CCC ACCCCTCCCAGAAAAAT-3'，產(chǎn)物長(zhǎng)度 480bp;β-actin(Gen-Bank:DQ407611.1)上游引物5'-AGTGTGACGTG-GACATCCGCA-3'，下游引物5'-ATCCACATCTGCTGGAAGGTGGAC-3'，產(chǎn)物長(zhǎng)度220 bp。循環(huán)條件:預(yù)變性94℃ 5 min，變性94℃ 40 s，退火58℃ 40 s，延伸72℃ 50 s，循環(huán)30次，終延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，應(yīng)用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行掃描。

1.3.5 Western blot檢測(cè) Bcl-2、Survivin、Bax 和Caspase-3蛋白的表達(dá)

1.3.5.1 細(xì)胞總蛋白提取

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的 SMMC-7721細(xì)胞，加入40 μmol/L姜黃素處理一定時(shí)間后，收集細(xì)胞，PBS洗滌兩次，加入細(xì)胞裂解液100 μL，4℃14000 rpm離心10 min，將上清按需分裝，保存于-70℃，蛋白濃度以改良Lowry法進(jìn)行蛋白定量。

1.3.5.2 Western blot檢測(cè)

各組取等量蛋白提取液，經(jīng)SDS-PAGE泳分離，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上;取膜并用5% 脫脂奶粉封閉后，與鼠抗人 Bcl-2、Survivin、Bax或 Caspase 3的單克隆抗體(1∶300)于4℃反應(yīng)過夜，洗膜后再與HRP標(biāo)記的相應(yīng)二抗(1∶10000)室溫反應(yīng)2 h，洗膜后利用增強(qiáng)性化學(xué)發(fā)光試劑盒(ECL)檢測(cè)特異性蛋白條帶，采用成像分析系統(tǒng)分析結(jié)果。

1.3.6 Western blot檢測(cè)姜黃素對(duì)JNK、ERK和p38 MAPK信號(hào)通路的影響

Western blot檢測(cè)JNK、ERK和p38 MAPK蛋白及磷酸化水平，一抗使用p-JNK/JNK、p-ERK/ERK和p-p38/p38 MAPK的單克隆抗體，方法同1.3.5。

1.3.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)用means±SD表示，采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，兩組以上數(shù)據(jù)間比較用方差分析，兩組間比較用t檢驗(yàn)，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 姜黃素可抑制人肝癌細(xì)胞SMMC-7721的增殖

以10、20、40 和 80 μmol/L 四種濃度的姜黃素分別處理人肝癌SMMC-7721細(xì)胞不同時(shí)間，檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。結(jié)果如圖1所示，MTT法檢測(cè)結(jié)果表明(圖 1A):與正常對(duì)照組相比，20、40 和 80 μmol/L的姜黃素明顯抑制SMMC-7721的增殖，且隨濃度的增大和時(shí)間的增加效果愈明顯。利用細(xì)胞計(jì)數(shù)法得到了同樣的結(jié)果，如圖1B所示。為了防止藥物的細(xì)胞毒性作用，后續(xù)試驗(yàn)姜黃素的濃度宜采用40 μmol/L，處理時(shí)間48 h。

圖1 姜黃素對(duì)人肝癌細(xì)胞SMMC-7721增殖的影響Fig.1 Effect of curcumin on proliferation of SMMC-7721 cells

2.2 姜黃素可誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞SMMC-7721凋亡

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，40 μmol/L的姜黃素作用于人肝癌細(xì)胞48 h后，與正常對(duì)照組Control相比，在實(shí)相圖上出現(xiàn)典型性細(xì)胞亞二倍體凋亡峰，細(xì)胞凋亡率為32.59%，明顯高于對(duì)照組的凋亡率1.89%，結(jié)果見表1和圖2。

表1 姜黃素對(duì)SMMC-7721細(xì)胞凋亡的影響 (n=6，means±SD)Table 1 Effect of curcumin on apoptosis of SMMC-7721 cells(n=6，means±SD)

圖2 姜黃素對(duì)人肝癌細(xì)胞SMMC-7721細(xì)胞凋亡的影響Fig.2 Effect of curcumin on apoptosis of SMMC-7721 cells

2.3 姜黃素可抑制人肝癌細(xì)胞SMMC-7721抗凋亡蛋白Bcl-2和Survivin的表達(dá)，誘導(dǎo)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)

為了明確姜黃素誘導(dǎo)人肝癌SMMC-7721細(xì)胞凋亡的機(jī)制，用40 μmol/L的姜黃素分別處理細(xì)胞12 h、24 h、48 h、72 h 后提取總 RNA 和蛋白，檢測(cè)SMMC-7721中凋亡相關(guān)蛋白基因的表達(dá)。RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示隨著姜黃素作用時(shí)間的延長(zhǎng)SMMC-7721細(xì)胞的抗凋亡蛋白Bcl-2和Survivin的表達(dá)量逐漸減少;而促凋亡蛋白Bax的表達(dá)逐漸增加，如圖3A所示，Western blot檢測(cè)結(jié)果與RT-PCR一致，如圖3B所示。表明，姜黃素誘導(dǎo)SMMC-7721細(xì)胞凋亡可能與上調(diào)Bax的表達(dá)、下調(diào)Bcl-2和Survivin的表達(dá)有關(guān)。

圖3 姜黃素對(duì)人肝癌細(xì)胞SMMC-7721細(xì)胞中Bcl-2、Survivin和Bax表達(dá)的影響Fig.3 Effect of curcumin on expression of Bcl-2，Survivin and Bax in SMMC-7721cells

2.4 姜黃素可誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞SMMC-7721中Caspase-3活性增強(qiáng)

用40 μmol/L的姜黃素分別處理細(xì)胞12、24、48、72 h后，Western blot檢測(cè)促凋亡蛋白Caspase 3的表達(dá)及活性的變化。隨著姜黃素作用時(shí)間的延長(zhǎng)，24 h后Caspase 3蛋白的表達(dá)量顯著提高，而其剪切后的活化型Caspase 3(p17亞基)的表達(dá)量48 h后顯著上升，結(jié)果見圖4。提示，姜黃素誘導(dǎo)人肝癌SMMC-7721細(xì)胞凋亡可能與增強(qiáng)Caspase 3活性增強(qiáng)有關(guān)。

圖4 姜黃素對(duì)人肝癌細(xì)胞SMMC-7721細(xì)胞中Caspase 3表達(dá)的影響Fig.4 Effect of curcumin on the expression of Caspase 3 in SMMC-7721cells

2.5 姜黃素激活人肝癌細(xì)胞SMMC-7721中JNK，抑制ERK和p38 MAPK信號(hào)通路

為了考察姜黃素誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞SMMC-7721凋亡的信號(hào)通路，用姜黃素處理培養(yǎng)的SMMC-7721細(xì)胞，觀察 MAPK信號(hào)通路三個(gè)主要成員，即ERK1/2、JNK、p38 MAPK 的變化。用 Western blot的方法檢測(cè)姜黃素處理后三個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白的磷酸化水平變化。結(jié)果顯示，當(dāng)40 μmol/L姜黃素作用于SMMC-7721細(xì)胞24 h后，JNK的磷酸化開始升高，48 h后明顯升高。ERK和p38 MAPK的磷酸化水平48 h后降低明顯，見圖5。表明，姜黃素可以激活人肝癌細(xì)胞SMMC-7721中的JNK信號(hào)通路、抑制ERK和p38 MAPK信號(hào)通路。

圖5 姜黃素對(duì)人肝癌細(xì)胞SMMC-7721細(xì)胞中MAPK信號(hào)通路的影響Fig.5 Effect of curcumin on MAPK pathway activity in SMMC-7721cells

2.6 姜黃素通過JNK，ERK和p38 MAPK信號(hào)通路影響人肝癌細(xì)胞SMMC-7721中Bax、Caspase 3、Bcl-2和Survivin的表達(dá)

為了驗(yàn)證姜黃素激活SMMC-7721細(xì)胞中JNK、抑制ERK和p38 MAPK信號(hào)通路與上調(diào)Bax和Caspase 3的表達(dá)、下調(diào)Bcl-2和Survivin的表達(dá)有關(guān)，分別檢測(cè)用JNK、ERK、p38 MAPK信號(hào)通路抑制劑SP600125、PD98059和SB203580對(duì)姜黃素處理SMMC-7721細(xì)胞后上述蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示，加入抑制PD98059和SB203580后，進(jìn)一步上調(diào)了Bax的表達(dá)、下調(diào)了Bcl-2和Survivin的表達(dá)(圖6A、B)，其中，兩種抑制劑引起的不同效應(yīng)是PD98059的加入并沒有顯著提升Caspase 3的活性。加入抑制劑SP600125后，下調(diào)了姜黃素誘導(dǎo)的Bax和Caspase 3的表達(dá)、上調(diào)了姜黃素抑制的Bcl-2和Survivin的表達(dá)(圖6C)。結(jié)果提示，JNK、ERK和p38 MAPK均可介導(dǎo)姜黃素對(duì)人肝癌細(xì)胞SMMC-7721中Bax、Caspase 3、Bcl-2和Survivin的表達(dá)。

圖6 MAPK抑制劑在姜黃素對(duì)人肝癌細(xì)胞SMMC-7721細(xì)胞中Bcl-2、Survivin、Bax和活性Caspase 3表達(dá)的影響Fig.6 Effect of MAPK inhibitor on the expression of Bcl-2，Survivin and Bax in SMMC-7721cells with curcumin

2.7 姜黃素通過JNK，ERK和p38 MAPK信號(hào)通路影響人肝癌細(xì)胞SMMC-7721凋亡

為了證明姜黃素激活JNK、抑制ERK和p38 MAPK信號(hào)通路與人肝癌SMMC-7721細(xì)胞凋亡有關(guān)，用信號(hào)通路抑制劑 SP600125、PD98059和SB203580處理細(xì)胞后流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的凋亡。如圖7所示，阻斷ERK和p38 MAPK信號(hào)通路后，與單純姜黃素誘導(dǎo)條件下相比(圖7B)，細(xì)胞的凋亡率進(jìn)一步上升(圖7C、D)。阻斷JNK信號(hào)通路后，細(xì)胞的凋亡率比單純姜黃素誘導(dǎo)條件下有所下降(圖7E)。柱形圖顯示各組的凋亡率。以上結(jié)果表明，JNK、ERK和p38 MAPK信號(hào)通路參與介導(dǎo)了姜黃素誘導(dǎo)的人肝癌SMMC-7721細(xì)胞的凋亡。

圖7 MAPK抑制劑在姜黃素對(duì)人肝癌細(xì)胞SMMC-7721細(xì)胞凋亡的影響Fig.7 Effect of MAPK inhibitor on SMMC-7721 cells apoptosis with curcumin

3 討論

姜黃素可以抑制多種癌細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)凋亡，其機(jī)制多與姜黃素多與增強(qiáng)Caspase的活性，干擾腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期，調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)。而姜黃素對(duì)于人肝癌細(xì)胞SMMC-7721的作用，以往的研究表明姜黃素可以抑制增殖并誘導(dǎo)凋亡，已發(fā)現(xiàn)機(jī)制為姜黃素作用于肝癌細(xì)胞后產(chǎn)生H2O2，H2O2損傷細(xì)胞線粒體并與膜電位降低有關(guān)，從而通過線粒體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［4］。姜黃素誘導(dǎo)人肝癌SMMC-7721細(xì)胞凋亡還與調(diào)節(jié)表達(dá)的Bax/bcl-2蛋白比例有關(guān)［5］。最近研究表明MAPK的活化也是諸多抗癌藥引起腫瘤細(xì)胞凋亡必需的，ERK MAPK由生長(zhǎng)因子所活化，對(duì)細(xì)胞的增殖和存活起著關(guān)鍵作用，抑制ERK的活性可以下調(diào)細(xì)胞中c-myc的表達(dá)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。目前普遍認(rèn)為p38 MAPK可以通過增強(qiáng)c-myc、Bax、Fas、Caspase 3等蛋白的表達(dá)、磷酸化p53、參與Fas/FasL介導(dǎo)的凋亡、激活c-jun和c-fos、誘導(dǎo)Bax轉(zhuǎn)位等途徑導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生凋亡。而JNK MAPK促進(jìn)凋亡的機(jī)制與增強(qiáng)Fas表達(dá)、調(diào)控Bcl-2的表達(dá)、改變細(xì)胞內(nèi)Ca2+環(huán)境和激活Caspase家族有關(guān)。以上表明，ERK、p38和JNK三組MAPK家族與癌細(xì)胞的凋亡密切相關(guān)［6］。本研究考察姜黃素作用于人肝癌細(xì)胞SMMC-7721后MAPK信號(hào)通路在細(xì)胞凋亡中的作用。研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素作用于人肝癌細(xì)胞SMMC-7721后，細(xì)胞的增殖受到抑制，細(xì)胞出現(xiàn)明顯的凋亡，Bax、Caspase 3的表達(dá)明顯增加而Bcl-2和Survivin的表達(dá)明顯減少。研究中還發(fā)現(xiàn)，姜黃素可以激活人肝癌細(xì)胞SMMC-7721的JNK信號(hào)通路、抑制ERK和p38 MAPK信號(hào)通路，阻斷這些信號(hào)通路后Bax、Caspase 3、Bcl-2和Survivin的表達(dá)發(fā)生變化。表明通過 MAPK信號(hào)通路上調(diào) Bax、Caspase 3的表達(dá)和下調(diào)Survivin、Bcl-2的表達(dá)是姜黃素誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的重要機(jī)制之一。

本文的研究中發(fā)現(xiàn)，與以前的報(bào)道相似的是姜黃素的作用并沒有明顯改變?nèi)烁伟┘?xì)胞SMMC-7721的細(xì)胞周期，也沒有引起細(xì)胞周期阻滯作用［7］。至于姜黃素是具有作用于其他腫瘤細(xì)胞，能夠增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞周期蛋白依賴激酶(CDK)的表達(dá)并抑制p21、p27和 p53等的表達(dá)的功能［8］，有待于進(jìn)一步考察。

在不同類型的細(xì)胞凋亡過程中，Caspase-3是細(xì)胞色素C下游的靶標(biāo)激活物，激活Caspase-3是線粒體-細(xì)胞色素C-細(xì)胞凋亡途徑中的關(guān)鍵步驟［9］。本實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，JNK和p38 MAPK信號(hào)通路與Caspase-3的活化有關(guān)，而ERK信號(hào)通路的阻斷沒有引起Caspase 3活性的明顯變化。推測(cè)可能是JNK和p38 MAPK信號(hào)通路與線粒體途徑有著共同的通路最終導(dǎo)致凋亡的發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)顯示姜黃素可以通過MAPK信號(hào)通路發(fā)揮誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的作用，在治療肝癌方面表現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景，這為姜黃素的臨床應(yīng)用提供了更多的理論依據(jù)。

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