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        姜黃素通過MAPK信號(hào)通路誘導(dǎo)人肝癌SMMC-7721細(xì)胞凋亡

        2014-10-25 10:23:52李會(huì)宣張紅兵
        關(guān)鍵詞:姜黃抑制劑肝癌

        李會(huì)宣,楊 虹,張紅兵,高 健

        1河北經(jīng)貿(mào)大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院,石家莊050061;2華北制藥集團(tuán)新藥研究開發(fā)有限責(zé)任公司抗體藥物研制國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,石家莊 050015

        姜黃素(Curcumin)是植物多酚類色素,廣泛存在于姜黃屬植物的根莖中,中藥姜黃的重要活性成分之一。姜黃素的主要藥理作用有抗氧化、抗炎、抗癌、降脂、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗纖維化、清除自由基等作用[1]。由于姜黃素?zé)o明顯的毒副作用,其抗腫瘤作用日益引起人們的重視,已成為腫瘤預(yù)防和治療的一個(gè)研究熱點(diǎn)[2]。姜黃素對(duì)于肝癌的作用,目前的研究多集中于體外抗腫瘤效應(yīng)[3],對(duì)其分子機(jī)制報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)對(duì)姜黃素抑制人肝癌SMMC-7721細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)凋亡作用及其可能的作用機(jī)制進(jìn)行初步的研究。通過觀察姜黃素對(duì)人肝癌SMMC-7721細(xì)胞增殖和凋亡的影響,檢測(cè)姜黃素對(duì)SMMC-7721細(xì)胞中 Caspase-3、Survivin、Bcl-2 和 Bax基因表達(dá)的影響,揭示姜黃素誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的信號(hào)通路,以期為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 實(shí)驗(yàn)材料

        肝癌細(xì)胞SMMC-7721(華北制藥集團(tuán)新藥研究開發(fā)有限責(zé)任公司惠贈(zèng));姜黃素(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)以少量二甲基亞砜(DMSO)溶解配制成1 mmol/L儲(chǔ)備溶液;RPMI-1640(Gibico公司);MTT、胎牛血清、DMSO、ERK特異性抑制劑PD98059、p38 MAPK特異性抑制劑 SB203580及JNK特異性抑制劑SP600125購自Sigma公司;Trizol試劑及RT-PCR反應(yīng)體系購自Promega公司;Survivin、Bcl-2和Bax的PCR引物由上海生物工程有限責(zé)任公司合成;鼠抗人 Caspase 3、Survivin、Bcl-2、Bax、β-actin、p-JNK/JNK、p-ERK/ERK 和 p-p38/p38的單克隆抗體,HRP聯(lián)連的兔抗鼠的二抗、化學(xué)發(fā)光試劑均為Santa Cruz公司產(chǎn)品。

        1.2 儀器與設(shè)備

        垂直電泳系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司),流式細(xì)胞儀(BD FACSCalibur),Gel DOC2000凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司),Microplate Reader 450酶標(biāo)儀(美國Bio-Rad公司),5415D離心機(jī)(基因科技公司),半干轉(zhuǎn)膜儀(美國Bio-Rad公司)和ID數(shù)碼成像分析系統(tǒng)(美國Kodak公司)。

        1.3 實(shí)驗(yàn)方法

        1.3.1 MTT法測(cè)定姜黃素對(duì)SMCC-7721細(xì)胞增殖的影響

        取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SMCC-7721細(xì)胞,0.25%胰蛋白酶消化分離,重新混懸于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液,調(diào)整細(xì)胞數(shù)為5×104cell/mL,以每孔200 μL加入96孔培養(yǎng)板中于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),貼壁24 h后分別加入終濃度為10、20、40和80 μmol/L的姜黃素,每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔,并設(shè)陰性和空白對(duì)照組,分別培養(yǎng) 12、24、48、72 h,每孔分別加入5 mg/mL MTT溶液40μL,振蕩后于37.0℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h,吸棄孔內(nèi)上清培養(yǎng)液,于每孔內(nèi)加入300 μL DMSO,使形成的甲月贊(ormazan)充分溶解,放入酶標(biāo)儀,選擇570 nm,空白孔調(diào)零,記錄各孔吸光度OD值。

        1.3.2 細(xì)胞計(jì)數(shù)法測(cè)定姜黃素對(duì)SMCC-7721細(xì)胞增殖的影響

        將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SMCC-7721細(xì)胞懸液以3×104~4×104cell/孔的密度接種于24孔板,培養(yǎng)12 h后,吸去培養(yǎng)液,隨機(jī)分組(n=5),加入正常培養(yǎng)液(不加姜黃素的Control組)或終濃度為10、20、40和80 μmol/L的姜黃素的培養(yǎng)液,培養(yǎng)一定時(shí)間后,用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù),以時(shí)間為橫軸、細(xì)胞數(shù)為縱軸做量效曲線。

        1.3.3 流式細(xì)胞儀(FCM)檢測(cè)姜黃素誘導(dǎo)SMMC-7721細(xì)胞的凋亡

        人肝癌SMMC-7721細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,換無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)12 h使細(xì)胞周期同步化,加入終濃度為40 μmol/L的姜黃素溶液培養(yǎng),正常對(duì)照Control組加入等量培養(yǎng)基,再培養(yǎng)48 h后,制成單細(xì)胞懸液,離心棄上清,沿管壁緩慢加入700 mL/L預(yù)冷(-20℃)乙醇固定,上機(jī)檢測(cè)前RNA酶消化,再加入PI染色液,4℃避光30 min,F(xiàn)CM檢測(cè)凋亡率及細(xì)胞周期。

        1.3.4 RT-PCR檢測(cè) Survivin、Bcl-2和 Bax的 mRNA的表達(dá)

        取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SMMC-7721細(xì)胞,加入40 μmol/L的姜黃素作用不同后采用Trizol一步法提取總RNA,取 1 μL 總 RNA 以 10 μL 體系逆轉(zhuǎn)錄,制備cDNA并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR。使用引物如下:Survivin(GenBank:U75285.1)上游引物5'-CCACCGCATCTCTACATTC-3',下游引物 5'-CTTTC TTCGCAGTTTCCTC-3',產(chǎn)物長(zhǎng)度 344 bp;Bcl-2(Gen-Bank:M13995.1)上游引物5'-ATGGCGCACGCTGGGAGAA-3',下 游 引 物 5'-CGGTAGCGGCGGGAGAAGTC-3',產(chǎn)物長(zhǎng)度 326bp;Bax(GenBank:AY217036.1)上游引物5'-ACCAAGAAGCTGAGCGAGTGTC-3',下游引物 5'-CCC ACCCCTCCCAGAAAAAT-3',產(chǎn)物長(zhǎng)度 480bp;β-actin(Gen-Bank:DQ407611.1)上游引物5'-AGTGTGACGTG-GACATCCGCA-3',下游引物5'-ATCCACATCTGCTGGAAGGTGGAC-3',產(chǎn)物長(zhǎng)度220 bp。循環(huán)條件:預(yù)變性94℃ 5 min,變性94℃ 40 s,退火58℃ 40 s,延伸72℃ 50 s,循環(huán)30次,終延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),應(yīng)用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行掃描。

        1.3.5 Western blot檢測(cè) Bcl-2、Survivin、Bax 和Caspase-3蛋白的表達(dá)

        1.3.5.1 細(xì)胞總蛋白提取

        取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的 SMMC-7721細(xì)胞,加入40 μmol/L姜黃素處理一定時(shí)間后,收集細(xì)胞,PBS洗滌兩次,加入細(xì)胞裂解液100 μL,4℃14000 rpm離心10 min,將上清按需分裝,保存于-70℃,蛋白濃度以改良Lowry法進(jìn)行蛋白定量。

        1.3.5.2 Western blot檢測(cè)

        各組取等量蛋白提取液,經(jīng)SDS-PAGE泳分離,電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上;取膜并用5% 脫脂奶粉封閉后,與鼠抗人 Bcl-2、Survivin、Bax或 Caspase 3的單克隆抗體(1∶300)于4℃反應(yīng)過夜,洗膜后再與HRP標(biāo)記的相應(yīng)二抗(1∶10000)室溫反應(yīng)2 h,洗膜后利用增強(qiáng)性化學(xué)發(fā)光試劑盒(ECL)檢測(cè)特異性蛋白條帶,采用成像分析系統(tǒng)分析結(jié)果。

        1.3.6 Western blot檢測(cè)姜黃素對(duì)JNK、ERK和p38 MAPK信號(hào)通路的影響

        Western blot檢測(cè)JNK、ERK和p38 MAPK蛋白及磷酸化水平,一抗使用p-JNK/JNK、p-ERK/ERK和p-p38/p38 MAPK的單克隆抗體,方法同1.3.5。

        1.3.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

        所有數(shù)據(jù)用means±SD表示,采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,兩組以上數(shù)據(jù)間比較用方差分析,兩組間比較用t檢驗(yàn),以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

        2.1 姜黃素可抑制人肝癌細(xì)胞SMMC-7721的增殖

        以10、20、40 和 80 μmol/L 四種濃度的姜黃素分別處理人肝癌SMMC-7721細(xì)胞不同時(shí)間,檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。結(jié)果如圖1所示,MTT法檢測(cè)結(jié)果表明(圖 1A):與正常對(duì)照組相比,20、40 和 80 μmol/L的姜黃素明顯抑制SMMC-7721的增殖,且隨濃度的增大和時(shí)間的增加效果愈明顯。利用細(xì)胞計(jì)數(shù)法得到了同樣的結(jié)果,如圖1B所示。為了防止藥物的細(xì)胞毒性作用,后續(xù)試驗(yàn)姜黃素的濃度宜采用40 μmol/L,處理時(shí)間48 h。

        圖1 姜黃素對(duì)人肝癌細(xì)胞SMMC-7721增殖的影響Fig.1 Effect of curcumin on proliferation of SMMC-7721 cells

        2.2 姜黃素可誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞SMMC-7721凋亡

        流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn),40 μmol/L的姜黃素作用于人肝癌細(xì)胞48 h后,與正常對(duì)照組Control相比,在實(shí)相圖上出現(xiàn)典型性細(xì)胞亞二倍體凋亡峰,細(xì)胞凋亡率為32.59%,明顯高于對(duì)照組的凋亡率1.89%,結(jié)果見表1和圖2。

        表1 姜黃素對(duì)SMMC-7721細(xì)胞凋亡的影響 (n=6,means±SD)Table 1 Effect of curcumin on apoptosis of SMMC-7721 cells(n=6,means±SD)

        圖2 姜黃素對(duì)人肝癌細(xì)胞SMMC-7721細(xì)胞凋亡的影響Fig.2 Effect of curcumin on apoptosis of SMMC-7721 cells

        2.3 姜黃素可抑制人肝癌細(xì)胞SMMC-7721抗凋亡蛋白Bcl-2和Survivin的表達(dá),誘導(dǎo)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)

        為了明確姜黃素誘導(dǎo)人肝癌SMMC-7721細(xì)胞凋亡的機(jī)制,用40 μmol/L的姜黃素分別處理細(xì)胞12 h、24 h、48 h、72 h 后提取總 RNA 和蛋白,檢測(cè)SMMC-7721中凋亡相關(guān)蛋白基因的表達(dá)。RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示隨著姜黃素作用時(shí)間的延長(zhǎng)SMMC-7721細(xì)胞的抗凋亡蛋白Bcl-2和Survivin的表達(dá)量逐漸減少;而促凋亡蛋白Bax的表達(dá)逐漸增加,如圖3A所示,Western blot檢測(cè)結(jié)果與RT-PCR一致,如圖3B所示。表明,姜黃素誘導(dǎo)SMMC-7721細(xì)胞凋亡可能與上調(diào)Bax的表達(dá)、下調(diào)Bcl-2和Survivin的表達(dá)有關(guān)。

        圖3 姜黃素對(duì)人肝癌細(xì)胞SMMC-7721細(xì)胞中Bcl-2、Survivin和Bax表達(dá)的影響Fig.3 Effect of curcumin on expression of Bcl-2,Survivin and Bax in SMMC-7721cells

        2.4 姜黃素可誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞SMMC-7721中Caspase-3活性增強(qiáng)

        用40 μmol/L的姜黃素分別處理細(xì)胞12、24、48、72 h后,Western blot檢測(cè)促凋亡蛋白Caspase 3的表達(dá)及活性的變化。隨著姜黃素作用時(shí)間的延長(zhǎng),24 h后Caspase 3蛋白的表達(dá)量顯著提高,而其剪切后的活化型Caspase 3(p17亞基)的表達(dá)量48 h后顯著上升,結(jié)果見圖4。提示,姜黃素誘導(dǎo)人肝癌SMMC-7721細(xì)胞凋亡可能與增強(qiáng)Caspase 3活性增強(qiáng)有關(guān)。

        圖4 姜黃素對(duì)人肝癌細(xì)胞SMMC-7721細(xì)胞中Caspase 3表達(dá)的影響Fig.4 Effect of curcumin on the expression of Caspase 3 in SMMC-7721cells

        2.5 姜黃素激活人肝癌細(xì)胞SMMC-7721中JNK,抑制ERK和p38 MAPK信號(hào)通路

        為了考察姜黃素誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞SMMC-7721凋亡的信號(hào)通路,用姜黃素處理培養(yǎng)的SMMC-7721細(xì)胞,觀察 MAPK信號(hào)通路三個(gè)主要成員,即ERK1/2、JNK、p38 MAPK 的變化。用 Western blot的方法檢測(cè)姜黃素處理后三個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白的磷酸化水平變化。結(jié)果顯示,當(dāng)40 μmol/L姜黃素作用于SMMC-7721細(xì)胞24 h后,JNK的磷酸化開始升高,48 h后明顯升高。ERK和p38 MAPK的磷酸化水平48 h后降低明顯,見圖5。表明,姜黃素可以激活人肝癌細(xì)胞SMMC-7721中的JNK信號(hào)通路、抑制ERK和p38 MAPK信號(hào)通路。

        圖5 姜黃素對(duì)人肝癌細(xì)胞SMMC-7721細(xì)胞中MAPK信號(hào)通路的影響Fig.5 Effect of curcumin on MAPK pathway activity in SMMC-7721cells

        2.6 姜黃素通過JNK,ERK和p38 MAPK信號(hào)通路影響人肝癌細(xì)胞SMMC-7721中Bax、Caspase 3、Bcl-2和Survivin的表達(dá)

        為了驗(yàn)證姜黃素激活SMMC-7721細(xì)胞中JNK、抑制ERK和p38 MAPK信號(hào)通路與上調(diào)Bax和Caspase 3的表達(dá)、下調(diào)Bcl-2和Survivin的表達(dá)有關(guān),分別檢測(cè)用JNK、ERK、p38 MAPK信號(hào)通路抑制劑SP600125、PD98059和SB203580對(duì)姜黃素處理SMMC-7721細(xì)胞后上述蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示,加入抑制PD98059和SB203580后,進(jìn)一步上調(diào)了Bax的表達(dá)、下調(diào)了Bcl-2和Survivin的表達(dá)(圖6A、B),其中,兩種抑制劑引起的不同效應(yīng)是PD98059的加入并沒有顯著提升Caspase 3的活性。加入抑制劑SP600125后,下調(diào)了姜黃素誘導(dǎo)的Bax和Caspase 3的表達(dá)、上調(diào)了姜黃素抑制的Bcl-2和Survivin的表達(dá)(圖6C)。結(jié)果提示,JNK、ERK和p38 MAPK均可介導(dǎo)姜黃素對(duì)人肝癌細(xì)胞SMMC-7721中Bax、Caspase 3、Bcl-2和Survivin的表達(dá)。

        圖6 MAPK抑制劑在姜黃素對(duì)人肝癌細(xì)胞SMMC-7721細(xì)胞中Bcl-2、Survivin、Bax和活性Caspase 3表達(dá)的影響Fig.6 Effect of MAPK inhibitor on the expression of Bcl-2,Survivin and Bax in SMMC-7721cells with curcumin

        2.7 姜黃素通過JNK,ERK和p38 MAPK信號(hào)通路影響人肝癌細(xì)胞SMMC-7721凋亡

        為了證明姜黃素激活JNK、抑制ERK和p38 MAPK信號(hào)通路與人肝癌SMMC-7721細(xì)胞凋亡有關(guān),用信號(hào)通路抑制劑 SP600125、PD98059和SB203580處理細(xì)胞后流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的凋亡。如圖7所示,阻斷ERK和p38 MAPK信號(hào)通路后,與單純姜黃素誘導(dǎo)條件下相比(圖7B),細(xì)胞的凋亡率進(jìn)一步上升(圖7C、D)。阻斷JNK信號(hào)通路后,細(xì)胞的凋亡率比單純姜黃素誘導(dǎo)條件下有所下降(圖7E)。柱形圖顯示各組的凋亡率。以上結(jié)果表明,JNK、ERK和p38 MAPK信號(hào)通路參與介導(dǎo)了姜黃素誘導(dǎo)的人肝癌SMMC-7721細(xì)胞的凋亡。

        圖7 MAPK抑制劑在姜黃素對(duì)人肝癌細(xì)胞SMMC-7721細(xì)胞凋亡的影響Fig.7 Effect of MAPK inhibitor on SMMC-7721 cells apoptosis with curcumin

        3 討論

        姜黃素可以抑制多種癌細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)凋亡,其機(jī)制多與姜黃素多與增強(qiáng)Caspase的活性,干擾腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期,調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)。而姜黃素對(duì)于人肝癌細(xì)胞SMMC-7721的作用,以往的研究表明姜黃素可以抑制增殖并誘導(dǎo)凋亡,已發(fā)現(xiàn)機(jī)制為姜黃素作用于肝癌細(xì)胞后產(chǎn)生H2O2,H2O2損傷細(xì)胞線粒體并與膜電位降低有關(guān),從而通過線粒體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[4]。姜黃素誘導(dǎo)人肝癌SMMC-7721細(xì)胞凋亡還與調(diào)節(jié)表達(dá)的Bax/bcl-2蛋白比例有關(guān)[5]。最近研究表明MAPK的活化也是諸多抗癌藥引起腫瘤細(xì)胞凋亡必需的,ERK MAPK由生長(zhǎng)因子所活化,對(duì)細(xì)胞的增殖和存活起著關(guān)鍵作用,抑制ERK的活性可以下調(diào)細(xì)胞中c-myc的表達(dá)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。目前普遍認(rèn)為p38 MAPK可以通過增強(qiáng)c-myc、Bax、Fas、Caspase 3等蛋白的表達(dá)、磷酸化p53、參與Fas/FasL介導(dǎo)的凋亡、激活c-jun和c-fos、誘導(dǎo)Bax轉(zhuǎn)位等途徑導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生凋亡。而JNK MAPK促進(jìn)凋亡的機(jī)制與增強(qiáng)Fas表達(dá)、調(diào)控Bcl-2的表達(dá)、改變細(xì)胞內(nèi)Ca2+環(huán)境和激活Caspase家族有關(guān)。以上表明,ERK、p38和JNK三組MAPK家族與癌細(xì)胞的凋亡密切相關(guān)[6]。本研究考察姜黃素作用于人肝癌細(xì)胞SMMC-7721后MAPK信號(hào)通路在細(xì)胞凋亡中的作用。研究發(fā)現(xiàn),姜黃素作用于人肝癌細(xì)胞SMMC-7721后,細(xì)胞的增殖受到抑制,細(xì)胞出現(xiàn)明顯的凋亡,Bax、Caspase 3的表達(dá)明顯增加而Bcl-2和Survivin的表達(dá)明顯減少。研究中還發(fā)現(xiàn),姜黃素可以激活人肝癌細(xì)胞SMMC-7721的JNK信號(hào)通路、抑制ERK和p38 MAPK信號(hào)通路,阻斷這些信號(hào)通路后Bax、Caspase 3、Bcl-2和Survivin的表達(dá)發(fā)生變化。表明通過 MAPK信號(hào)通路上調(diào) Bax、Caspase 3的表達(dá)和下調(diào)Survivin、Bcl-2的表達(dá)是姜黃素誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的重要機(jī)制之一。

        本文的研究中發(fā)現(xiàn),與以前的報(bào)道相似的是姜黃素的作用并沒有明顯改變?nèi)烁伟┘?xì)胞SMMC-7721的細(xì)胞周期,也沒有引起細(xì)胞周期阻滯作用[7]。至于姜黃素是具有作用于其他腫瘤細(xì)胞,能夠增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞周期蛋白依賴激酶(CDK)的表達(dá)并抑制p21、p27和 p53等的表達(dá)的功能[8],有待于進(jìn)一步考察。

        在不同類型的細(xì)胞凋亡過程中,Caspase-3是細(xì)胞色素C下游的靶標(biāo)激活物,激活Caspase-3是線粒體-細(xì)胞色素C-細(xì)胞凋亡途徑中的關(guān)鍵步驟[9]。本實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn),JNK和p38 MAPK信號(hào)通路與Caspase-3的活化有關(guān),而ERK信號(hào)通路的阻斷沒有引起Caspase 3活性的明顯變化。推測(cè)可能是JNK和p38 MAPK信號(hào)通路與線粒體途徑有著共同的通路最終導(dǎo)致凋亡的發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)顯示姜黃素可以通過MAPK信號(hào)通路發(fā)揮誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的作用,在治療肝癌方面表現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景,這為姜黃素的臨床應(yīng)用提供了更多的理論依據(jù)。

        1 Wang HS(王華森),Huai QY(懷其勇).Preparation and antimicrobial activities of curcumin derivatives.Nat Prod Res Dev(天然產(chǎn)物研究與開發(fā)),2013,25:237-240.

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