馮流星　王軍

摘要：針對目前采用同位素稀釋激光剝蝕電感耦合等離子體質(zhì)譜（IDLAICPMS）對固體生物組織切片樣品難以實現(xiàn)原位準確定量的難題，本研究將同位素稀釋法與LAICPMS技術相結合，通過開展生物組織樣品與濃縮稀釋劑的同位素充分交換平衡、稀釋劑添加方式、原位的同位素比測量等關鍵技術研究，確定了組織切片與同位素稀釋劑的最佳平衡時間、稀釋劑的質(zhì)量以及選用甲醇作為稀釋劑溶劑等實驗條件，建立了基于同位素稀釋技術的LAICPMS技術在生物樣品組織切片中Fe元素的微區(qū)定量分析方法，并采用實驗室自行制備的均勻的山羊腦和牛肝組織切片標準樣品對方法進行了驗證，通過IDLAICPMS方法的測量結果與微波消解同位素稀釋方法的測量結果相一致，驗證了該方法的有效性和可靠性。本方法可進一步應用于臨床中生物組織切片樣品中金屬元素的原位、微區(qū)定量測量及成像分析。

關鍵詞：同位素稀釋； 激光剝蝕電感耦合等離子體質(zhì)譜； 原位微區(qū)定量； 組織切片

1引言

激光剝蝕電感耦合等離子體質(zhì)譜（LAICPMS）是在質(zhì)譜檢測的基礎上結合激光剝蝕進樣技術而成的一種固體微區(qū)分析新技術[1]。該技術固體進樣前處理相對簡單，引入等離子體的干氣溶膠較濕法進樣干擾少，且其原位（insitu）、微區(qū)、快速的分析優(yōu)勢，以及靈敏度高、檢出限低、空間分辨率小于10 μm、可進行多種元素含量和同位素組成測量的能力成為已成為生物醫(yī)學研究中一種很有潛力的分析方法，近年來已成為質(zhì)譜分析技術應用的前沿。在生物臨床領域中的應用報道中，研究對象涉及植物[2～4]、動物腦[5～8]和其它生物組織切片[9～13]樣品等。然而，LAICPMS技術在生物臨床領域的應用中，由于目前與待測樣品基體相匹配的標準物質(zhì)或標準樣品還相當匱乏，而該技術本身受樣品基體效應、分餾效應、質(zhì)量歧視等是影響又十分嚴重，導致LAICPMS在準確定量分析方面存在較大困難[14]。目前，LAICPMS應用研究多集中于元素含量的相對測量，即用相對計數(shù)表示含量，不能給出絕對量值，難以滿足生物醫(yī)學研究中對生物組織樣品原位、微區(qū)元素分布準確定量分析的要求。

同位素稀釋質(zhì)譜法（IDMS）是國際公認的高準確度分析方法之一，如能將靈敏、準確的同位素稀釋技術與可以實現(xiàn)原位、微區(qū)分析的LAICPMS結合，將為解決LAICPMS進行生物樣品原位微區(qū)準確定量元素測量提供一條理想途徑。目前，基于IDMS技術LAICPMS定量方法研究，主要包括兩種方案：（1）固體稀釋劑標記技術（Solidspiking for direct analysis）。通過采用溶液稀釋劑與固體樣品混合、均勻化、干燥等步驟，使稀釋劑與固體樣品中待測元素發(fā)生同位素交換，制備出可用于標記待測固體樣品的固體稀釋劑，該固體稀釋劑可以與待測樣品混合、均勻、壓片后，用于LAICPMS測量的樣品[15～17]。該方法由于采用了IDMS技術，使得LAICPMS定量分析準確度有所提高，減小了測量不確定度，然而卻不能應用于組織切片的原位、微區(qū)分析。（2）溶液稀釋劑在線引入技術[18～20]。即通過溶液稀釋劑在線引入到激光剝蝕樣品池，在池中與剝蝕固體樣品產(chǎn)生的氣溶膠混合并發(fā)生同位素交換，混合氣溶膠引入到ICPMS中進行測量。這種方式制樣過程相對簡單，適用性較強，沒有樣品與稀釋劑混合、均勻化的過程，因此可應用于組織切片樣品的原位、微區(qū)定量分析。然而，此方法在應用中還存在兩個技術難點：一是如何確定與待測樣品發(fā)生反應的稀釋劑質(zhì)量；二是如何確定稀釋劑與樣品之間的同位素交換是否達到平衡。目前，將IDMS方法與LAICPMS相結合，用于組織切片樣品的原位、微區(qū)絕對定量分析尚未見報道。

本研究基于同位素稀釋法與LAICPMS相結合的技術，開展了生物組織樣品與濃縮稀釋劑的同位素充分交換平衡、稀釋劑添加方式、原位的同位素比測量等關鍵技術的探索性研究，建立了同位素稀釋LAICPMS技術在生物樣品組織切片中Fe元素原位定量分析方法，并采用自行制備的均勻的山羊腦和牛肝組織切片標準樣品驗證了方法的有效性和可靠性。在下一步的研究中，本方法將應用到小鼠腦組織切片中鐵元素的二維原位微區(qū)掃描中，給出小鼠腦組織中鐵元素的原位、微區(qū)定量測量及成像分布結果，這將對于腦中鐵元素的分布變化與老年癡呆病的聯(lián)系研究具有重要的臨床意義。

2實驗部分

2.1儀器與試劑

UP213 Nd：YAG激光剝蝕系統(tǒng)（美國New Wave公司），高分辨電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（ELEMENT 2，美國Thermo公司），全自動冷凍切片機（德國SLEE公司），免疫組化筆（Liquid blocker pen，美國Sigma公司）。

本實驗中所用的山羊腦組織樣品由英國LGC提供；用于切片的牛肝樣品為SRM1577c （NIST，美國）；明膠試劑（美國Sigma公司）；57FeO濃縮同位素稀釋劑（99.99%，國際原子能機構（IAEA）），該稀釋劑樣品經(jīng)消解、稀釋、定容后配制成0.3053 μg/g，用MCICPMS測定56Fe/57Fe為0.03154。10 ng/g的Li， Y， Tl調(diào)諧液及玻璃標準物質(zhì)SRM610 （NIST，美國）用于優(yōu)化LA及HRICPMS的儀器條件。

2.2樣品前處理

4結論

針對目前采用的IDLAICPMS對固體生物組織樣品難以實現(xiàn)原位準確定量的難題，本研究將同位素稀釋法與LAICPMS技術結合，開展了生物組織樣品與濃縮稀釋劑的同位素充分交換平衡、稀釋劑添加方式、原位的同位素比測量等關鍵技術的探索研究，通過對山羊腦組織和牛肝組織樣品切片的原位定量分析的應用與比較，證明了本方法對實現(xiàn)生物組織樣品原位準確定量分析具有可行性。在下一步的工作中，將進一步將該方法應用到小鼠腦組織切片中，開展腦組織中Fe元素的原位、微區(qū)定量分析，并開展同位素稀釋劑的形態(tài)差異對生物組織中元素微區(qū)原位定量結果的影響研究。

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