魯嘉等

摘要：利用紫外可見（UVvis）吸收光譜、熒光（FL）光譜和圓二色譜（CD）研究了3種有機(jī)氯農(nóng)藥＼[DDT， DDE和DDD＼]與人類腫瘤相關(guān)基因（p53 DNA和Cmyc DNA）的相互作用，闡明有機(jī)氯農(nóng)藥的基因毒性。UVvis和FL光譜實(shí)驗(yàn)表明， 有機(jī)氯農(nóng)藥主要通過(guò)嵌插方式與DNA堿基作用，形成非共價(jià)復(fù)合物。通過(guò)FL實(shí)驗(yàn)得到的農(nóng)藥分子與p53 DNA的結(jié)合能力順序?yàn)椋篋DE>DDT>DDD，對(duì)Cmyc DNA為：DDD>DDE>DDT；并通過(guò)計(jì)算結(jié)合過(guò)程的熱力學(xué)常數(shù)證實(shí)以疏水作用為主要的作用力。CD實(shí)驗(yàn)表明， 部分有機(jī)氯農(nóng)藥能夠影響DNA的堿基對(duì)堆積和二級(jí)結(jié)構(gòu)，很可能進(jìn)一步造成DNA損傷，并最終導(dǎo)致基因突變。

關(guān)鍵詞：有機(jī)氯農(nóng)藥； 脫氧核糖核酸； 相互作用； 光譜法； 嵌插作用

1引言

有機(jī)氯農(nóng)藥主要以苯或環(huán)戊二烯兩大類為原料，曾作為殺蟲劑被廣泛使用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，其化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定和難以分解的特性造成了環(huán)境的嚴(yán)重污染。接觸有機(jī)氯農(nóng)藥后，罹患白血病、乳腺癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）腫瘤以及Wilm′s腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)增大[1，2]。已有研究表明， 有機(jī)氯農(nóng)藥能對(duì)人體血紅細(xì)胞和淋巴細(xì)胞中DNA造成損傷，具有誘導(dǎo)基因癌變的可能性[3，4]。80%腫瘤疾病受到環(huán)境因素的影響[5，6]。因此有必要在分子水平上探討環(huán)境中有機(jī)小分子與人類腫瘤相關(guān)DNA間的作用機(jī)制。小分子物質(zhì)與DNA之間的非共價(jià)結(jié)合方式主要有嵌插結(jié)合、溝區(qū)結(jié)合和靜電結(jié)合，其中當(dāng)小分子嵌插到DNA堿基對(duì)之間后，可以直接抑制DNA的復(fù)制與轉(zhuǎn)錄，甚至使DNA鏈斷裂受損。此外，有機(jī)小分子可能會(huì)與DNA形成加合物而引起DNA的損傷，有可能產(chǎn)生誘變作用而最終引發(fā)癌變[7，8]。 p53基因是一種抑癌基因，人類癌癥中約有一半是由于該基因發(fā)生突變失活，是迄今發(fā)現(xiàn)與人類腫瘤相關(guān)性最高的基因[9～12]。Cmyc基因是一種可使細(xì)胞獲永生化功能，促進(jìn)細(xì)胞分裂的基因[13，14]。研究發(fā)現(xiàn)， 多種腫瘤疾病中都發(fā)現(xiàn)有Cmyc基因的擴(kuò)增或過(guò)度表達(dá)[15，16]。

本研究選擇3種有機(jī)氯農(nóng)藥DDT及其在環(huán)境中脫氧化氫產(chǎn)物DDE和還原產(chǎn)物DDD（圖1）為研究對(duì)象，利用一些譜學(xué)方法系統(tǒng)研究這些農(nóng)藥與人體腫瘤相關(guān)基因（p53抑癌基因和Cmyc癌基因）啟動(dòng)子區(qū)雙螺旋DNA間的相互作用，希望能為農(nóng)藥生物毒性的解析、腫瘤疾病的預(yù)防和治療提供線索。

3結(jié)果與討論

3.1紫外滴定實(shí)驗(yàn)研究有機(jī)氯農(nóng)藥分子與DNA的作用模式

研究證明，有機(jī)小分子與DNA的相互作用會(huì)引起小分子的特征吸收帶出現(xiàn)紅移（藍(lán)移）現(xiàn)象或增色（減色）效應(yīng)。尤其是以嵌插方式與DNA堿基對(duì)發(fā)生作用時(shí)，小分子的光譜變化會(huì)更明顯。隨著DNA的加入，有機(jī)氯農(nóng)藥分子溶液的UVvis吸收光譜變化明顯。由圖2A可知，在加入p53 DNA之后，有機(jī)氯農(nóng)藥DDE在213和288 nm處的特征吸收峰分別發(fā)生了15和11 nm的紅移，同時(shí)減色程度分別為63.8%和30.2%，并且在337 nm處出現(xiàn)等吸收點(diǎn)。而在加入Cmyc DNA之后，DDD的光譜信號(hào)變化最為顯著，其位于209和243 nm處的特征吸收峰分別減色55.8%和42.9%，209 nm處特征紫外吸收峰出現(xiàn)了8 nm的紅移，在298 nm處出現(xiàn)了等吸收點(diǎn)，而243 nm處特征吸收峰的位移不明顯。吸光度的顯著減弱以及吸收帶發(fā)生紅移都證實(shí)了有機(jī)氯農(nóng)藥分子嵌插入DNA的堿基對(duì)之間與DNA結(jié)合[17]，等吸收點(diǎn)的出現(xiàn)說(shuō)明有機(jī)氯農(nóng)藥分子和DNA之間形成非共價(jià)復(fù)合物[18]。

3.3熒光競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)比較有機(jī)氯農(nóng)藥分子與DNA作用的親合能力

溴化乙錠（EB）是一種具有共軛芳香環(huán)的平面分子，在TrisHCl緩沖溶液中，單獨(dú)的EB熒光非常弱，但它能平行地嵌入雙螺旋DNA的堿基對(duì)中，使熒光顯著增強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)利用EB作為目標(biāo)DNA的熒光探針，通過(guò)熒光競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)研究有機(jī)氯農(nóng)藥分子與DNA嵌插作用的親合力。結(jié)果表明，隨著有機(jī)氯農(nóng)藥濃度不斷增加，DNAEB體系的熒光強(qiáng)度逐漸減弱，表明有機(jī)氯農(nóng)藥分子會(huì)和EB競(jìng)爭(zhēng)與DNA結(jié)合于DNA的作用位點(diǎn)（圖3），使得嵌插在DNA堿基對(duì)中的EB不斷被置換出來(lái)。

小分子與DNA的相互作用有可能受多種作用的共同影響，通過(guò)在熒光光譜實(shí)驗(yàn)中改變?nèi)芤旱碾x子強(qiáng)度來(lái)判斷有機(jī)氯農(nóng)藥分子與DNA分子之間是否有靜電作用。溶液中離子強(qiáng)度的增加能夠抑制有機(jī)氯農(nóng)藥分子與DNA分子之間通過(guò)靜電作用相互結(jié)合，表現(xiàn)為熒光猝滅減弱。本實(shí)驗(yàn)利用強(qiáng)電解質(zhì)NaCl控制有機(jī)氯農(nóng)藥和DNA體系的離子強(qiáng)度，實(shí)驗(yàn)見表3。由表3可知，在加入NaCl溶液后，有機(jī)氯農(nóng)藥與DNA溶液體系的熒光強(qiáng)度未增大反而減小，表明有機(jī)氯農(nóng)藥和DNA之間沒(méi)有靜電作用。雙鏈DNA之間由于磷酸基團(tuán)帶有負(fù)電荷而產(chǎn)生靜電斥力，隨著離子強(qiáng)度增大，Na+中和了DNA磷酸根的負(fù)電荷，減弱了PO3+4之間的斥力，使DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)分子軸向收縮，表現(xiàn)為熒光強(qiáng)度的減小[22]。

靜態(tài)猝滅中，猝滅劑的存在不改變熒光分子激發(fā)態(tài)的壽命，動(dòng)態(tài)猝滅中，猝滅劑的存在可導(dǎo)致其熒光壽命縮短。由表6可知，有機(jī)氯農(nóng)藥分子DDD和DDT在加入DNA前后熒光壽命變化較小，表明有DDD與DDT與DNA之間的猝滅模式為靜態(tài)猝滅，而隨著DNA的加入DDE的熒光壽命明顯增大，表明DDE與 DNA的溝區(qū)之間也有一定的相互作用[25]。

3.7圓二色譜研究有機(jī)氯農(nóng)藥分子對(duì)DNA結(jié)構(gòu)的影響

小分子不僅能夠通過(guò)嵌插等作用影響DNA堿基對(duì)的堆積，而且能夠影響DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)。CD譜中，260～280 nm處的正峰對(duì)應(yīng)DNA堿基對(duì)堆積，245 nm處的負(fù)峰對(duì)應(yīng)DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的B型構(gòu)象[26] 。當(dāng)有小分子與DNA分子發(fā)生相互作用，影響DNA分子結(jié)構(gòu)，其CD譜會(huì)發(fā)生變化。圖6為結(jié)合最為顯著的2種有機(jī)氯農(nóng)藥與相應(yīng)DNA溶液的CD譜圖。對(duì)于p53 DNA，農(nóng)藥DDE的加入使得DNA正負(fù)峰都明顯減弱，這說(shuō)明DDE的加入不但會(huì)削弱堿基對(duì)之間ππ堆積作用，而且影響了DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)構(gòu)象，會(huì)導(dǎo)致雙螺旋結(jié)構(gòu)的松散甚至發(fā)生解鏈；而DDD和DDT對(duì)p53 DNA的CD譜沒(méi)有明顯影響。對(duì)于Cmyc DNA，農(nóng)藥DDD的加入使得DNA正負(fù)峰都發(fā)生減弱，這說(shuō)明DDD的加入能夠削弱了Cmyc堿基對(duì)之間ππ堆積作用，并對(duì)其構(gòu)象造成一定影響；DDT和DDE的加入使得Cmyc DNA負(fù)峰明顯減弱，說(shuō)明對(duì)DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)有較大影響。造成這種差異的原因是由于有機(jī)氯農(nóng)藥的毒性與其分子形狀和大小有關(guān)，Mullin的假設(shè)即強(qiáng)調(diào)了分子構(gòu)型對(duì)分子毒性的影響[27]。DDT中的三氯甲基和DDE中雙鍵的空間位阻較大，抑制苯環(huán)平面結(jié)構(gòu)的自由旋轉(zhuǎn)，不利于其分子以最優(yōu)的角度嵌插入DNA堿基對(duì)間[28]，影響了DNA雙螺旋B型構(gòu)象。而DDD苯環(huán)平面結(jié)構(gòu)能夠自由旋轉(zhuǎn)，有利于DDD嵌插入DNA堿基對(duì)，所以DDD能夠同時(shí)影響DNA的堿基對(duì)堆積和B型構(gòu)象。

4結(jié)論

綜上所述，不同農(nóng)藥分子對(duì)DNA作用力大小存在顯著差異，其中DDD和p53 DNA結(jié)合能力最強(qiáng)，而與Cmyc DNA結(jié)合能力最弱，具有較為顯著的結(jié)合特異性。有機(jī)氯農(nóng)藥DDD、DDT、DDE都基本以嵌插方式與DNA發(fā)生作用，瞬態(tài)熒光實(shí)驗(yàn)證明DDE與DNA雙螺旋的溝區(qū)也存在一定的相互作用。熱力學(xué)函數(shù)的計(jì)算結(jié)果表明有機(jī)氯農(nóng)藥分子和DNA之間的作用力類型主要存在疏水作用。CD實(shí)驗(yàn)以及紫外升溫證明有機(jī)氯農(nóng)藥能夠影響DNA堿基對(duì)間的堆積作用或DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)，造成DNA穩(wěn)定性降低。這些影響可能是有機(jī)氯農(nóng)藥分子具有致癌作用的原因。

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4結(jié)論

綜上所述，不同農(nóng)藥分子對(duì)DNA作用力大小存在顯著差異，其中DDD和p53 DNA結(jié)合能力最強(qiáng)，而與Cmyc DNA結(jié)合能力最弱，具有較為顯著的結(jié)合特異性。有機(jī)氯農(nóng)藥DDD、DDT、DDE都基本以嵌插方式與DNA發(fā)生作用，瞬態(tài)熒光實(shí)驗(yàn)證明DDE與DNA雙螺旋的溝區(qū)也存在一定的相互作用。熱力學(xué)函數(shù)的計(jì)算結(jié)果表明有機(jī)氯農(nóng)藥分子和DNA之間的作用力類型主要存在疏水作用。CD實(shí)驗(yàn)以及紫外升溫證明有機(jī)氯農(nóng)藥能夠影響DNA堿基對(duì)間的堆積作用或DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)，造成DNA穩(wěn)定性降低。這些影響可能是有機(jī)氯農(nóng)藥分子具有致癌作用的原因。

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綜上所述，不同農(nóng)藥分子對(duì)DNA作用力大小存在顯著差異，其中DDD和p53 DNA結(jié)合能力最強(qiáng)，而與Cmyc DNA結(jié)合能力最弱，具有較為顯著的結(jié)合特異性。有機(jī)氯農(nóng)藥DDD、DDT、DDE都基本以嵌插方式與DNA發(fā)生作用，瞬態(tài)熒光實(shí)驗(yàn)證明DDE與DNA雙螺旋的溝區(qū)也存在一定的相互作用。熱力學(xué)函數(shù)的計(jì)算結(jié)果表明有機(jī)氯農(nóng)藥分子和DNA之間的作用力類型主要存在疏水作用。CD實(shí)驗(yàn)以及紫外升溫證明有機(jī)氯農(nóng)藥能夠影響DNA堿基對(duì)間的堆積作用或DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)，造成DNA穩(wěn)定性降低。這些影響可能是有機(jī)氯農(nóng)藥分子具有致癌作用的原因。

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