曹思源+王芳+丁國華+李佳琦+高歌+安夢妍

摘 要：以中華水韭為試驗材料，用200μmol·L-1的氯化鎘溶液和2g·L-1的硝酸鉛分別對其進行脅迫處理，采用cDNA-AFLP技術(shù)分離差異表達基因，通過Blast（The Basic Local Alignment Search Tool）同源性比對分析基因功能，為尋找耐重金屬脅迫相關(guān)基因和揭示水韭對環(huán)境變化響應的分子機理奠定基礎(chǔ)。試驗結(jié)果如下：共有15條差異條帶被成功克隆和測序，其中13條差異片段可以在數(shù)據(jù)庫找到與之同源的序列。鎘脅迫差異表達TDF9與ABC型（ATP-binding cassette）轉(zhuǎn)運蛋白C亞族基因有84%同源性。鉛脅迫差異表達TDF4和TDF7與環(huán)形鋅指蛋白（RING Zinc Finger Protein）有75%同源性。這些基因的發(fā)現(xiàn)為揭示水韭對環(huán)境變化敏感的分子機理奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：中華水韭；重金屬脅迫；鉛；鎘；cDNA-AFLP

中圖分類號 Q948.116 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2014）18-22-03

當前土壤和水域的重金屬污染日益嚴重，為此國家于2013年啟動了重金屬污染耕地修復的試點[1]。重金屬（主要是鎘、鉛、砷、汞、鉻等）不僅嚴重影響植物的生長發(fā)育，而且通過糧食及蔬菜進入人體并積累，威脅人類身體健康。其中鎘和鉛毒性最強，污染也最嚴重[2]。

中華水韭（Isoetes sinensis Palmer），小型葉蕨類，為水韭科水韭屬（孑遺屬）沼澤指示植物，因生存環(huán)境的變遷和生存區(qū)域的減少，已成為瀕危物種，被列為國家一級重點保護野生植物[3]。對中華水韭生境調(diào)查發(fā)現(xiàn)，土壤中鎘和鉛的含量嚴重超標[4]。研究表明，中華水韭對除草劑[5]和重金屬鉛有很高的耐受性，因此，研究“植物活化石”中華水韭對重金屬脅迫的響應，特別是在基因表達方面的響應，對于揭示中華水韭對重金屬脅迫響應的分子機制及植物響應逆境的原始反應機制有著重要意義。

1 材料和方法

1.1 試驗材料 試材中華水韭為我院蕨類研究室繁殖培養(yǎng)的植株。于2011年4月選取長勢整齊一致的中華水韭植株，用水沖洗去除根部泥土，毎3株為一組放入裝有蒸餾水的容器中重新培養(yǎng)至長出新根。待根生長至3cm長時，倒掉蒸餾水，添加等體積的Hoagland完全營養(yǎng)液，每7d更換一次營養(yǎng)液，約30d后植株恢復長勢進行重金屬脅迫處理。

1.2 重金屬脅迫處理 處理前倒掉營養(yǎng)液，加等量去離子水。2d后倒掉去離子水，對照組仍加去離子水，處理組分別加等量200μmol·L-1的氯化鎘溶液和2g·L-1的硝酸鉛。自脅迫處理開始，分別于第6h、24h、72h煎取中部長勢良好葉片迅速放到液氮中冷凍，并保存在-80℃冰箱中，用于RNA提取。

1.3 cDNA-AFLP分析 RNA提取采用天根生化試劑（北京）有限公司的植物總RNA提取試劑盒，雙鏈cDNA的合成采用寶生物公司的cDNA Synthesis Kit（M-MLV Version）試劑盒，紫外分光光度計測定雙鏈cDNA濃度，并調(diào)整各樣品濃度為80ng·μL-1。AFLP流程及反應體系參照黃河等[6]的方法進行，具體操作如下：（1）酶切：用EcoR I和Mse I對反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA進行雙酶切。（2）連接：將EcoR I-adaptor、Mse I-adaptor接頭用T4 DNA Ligase連接。（3）預擴增：用EcoR I-00和Mse I-00為引物進行預擴增。（4）選擇性擴增：通用引物（E1～8，M1～8，共64個引物組合）進行選擇性擴增。（5）聚丙烯酰胺凝膠電泳。

1.4 差異表達片段的回收、克隆、測序及同源性分析 將聚丙烯酰胺凝膠上差異條帶用滅菌的鋒利刀片切下，煮沸法回收DNA，以回收產(chǎn)物為模板，用對應的引物組合重新進行PCR擴增。擴增體系和反應條件跟預擴增體系相同。擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，并送上海生工生物工程公司測序。測序結(jié)果提交NCBI進行Blastx同源性比對。

2 結(jié)果與分析

2.1 差異表達條帶的統(tǒng)計和分類 根據(jù)鎘和鉛脅迫的cDNA-AFLP電泳圖將差異表達條帶進行統(tǒng)計并分類，大致分成4類：（1）I類型條帶：條帶在正常情況和整個重金屬脅迫的過程都存在。基因的表達水平在正常情況和整個重金屬脅迫的過程中沒有任何改變。（2）II類型條帶：在正常情況和重金屬脅迫初期存在，隨著重金屬脅迫強度的加大，基因的表達量減弱或消失隨后又增強。（3）III類型條帶：在正常情況下沒有或表達很弱，在重金屬脅迫的過程中開始表達或表達量加強。（4）IV類型條帶：在正常情況下存在，在重金屬脅迫過程中條帶消失，不再表達。

將鉛和鎘脅迫的差異條帶進行統(tǒng)計，總共統(tǒng)計出184條差異表達TDFs。其中，I類型差異表達TDFs為24條，占總數(shù)的13%；II類型差異表達TDFs為24條，占總數(shù)的13%；III類型差異表達TDFs為109條，占總數(shù)的59%；IV類型差異表達TDFs為27條，占總數(shù)的15%。

2.2 差異表達條帶的測序和同源性分析 鉛脅迫和鎘脅迫的聚丙酰胺凝膠中共挑選出15條差異條帶進行回收，條帶都可以被選擇性擴增引物重新擴增，這些條帶分布主要在500～250bp范圍內(nèi)。將回收的15條差異片段TDFs進行測序，測序后的差異條帶與純化后的片段長度一致，試驗中所用的接頭序列與測序片段兩端序列一致，表明序列測定結(jié)果可靠。將15條差異條帶測序結(jié)果用NCBI中的Blastn和Blastx進行同源序列的比對，其同源性比對結(jié)果見表1。

表1 差異表達基因片段在NCBI進行的Blast比對

[TDFs＼&Size（bp）＼&Sequence similarity＼&E value＼&TDF1＼&604＼&Hypothetical protein SELMODRAFT_177510＼&a9e-66＼&TDF2＼&402＼&Triticum aestivum cDNA，clone： WT003_G01，cultivar： Chinese Spring＼&1e-70＼&TDF3＼&316＼&No match＼&＼&TDF4＼&274＼&V-type proton ATPase subunit G-like isoform 1＼&a2e-09＼&zinc finger RING-type protein＼&a9e-09＼&TDF5＼&131＼&No match＼&＼&TDF6＼&168＼&Isoetes engelmannii 18S ribosomal RNA gene，partial sequence＼&4e-47＼&TDF7＼&205＼&PREDICTED： V-type proton ATPase subunit G-like isoform 1 [Cucumis sativus]＼&a7e-10＼&zinc finger RING-type protein [Cucumis sativus]＼&a3e-09＼&TDF8 ＼&177＼&hypothetical protein [Pseudomonas sp.PAMC 26793]＼&a1e-12＼&TDF9＼&398＼&Medicago truncatula ABC transporter C family member （MTR_8g040620） mRNA，complete cds＼&7e-34＼&TDF10＼&373＼&No match＼&＼&TDF11＼&285＼&ABC transporter B family protein＼&a2.0＼&putative 4-alpha-glucanotransferase [Prevotella disiens]＼&a7.1＼&TDF12＼&371＼&pentatricopeptide repeat-containing protein At1g11290-like [Vitis vinifera]＼&a3e-23＼&TDF13endprint

＼&80＼&retrotransposon protein，putative，unclassified [Oryza sativa Japonica Group]＼&a2.8＼&TDF14＼&410＼&RecName：Full=Transposon TX1 uncharacterized 149 kDa protein； AltName： Full=ORF 2＼&9e-05＼& retrotransposon protein，putative，unclassified [Oryza sativa Japonica Group]＼&a1e-07＼&putative non-LTR retroelement reverse transcriptase [Oryza sativa Japonica Group]＼&a1e-07＼&TDF15 ＼&336＼&Predicted RNA-binding protein homologous to eukaryotic snRNP [Ruminococcus obeum A2-162]＼&a3.6＼&]

注：a表示進行blastx比對得到的，其余是進行blastn比對得到的；TDF1-8為鉛脅迫差異表達基因，TDF 9-15為鎘脅迫差異表達基因。

在測序成功的差異片段中，通過blastx同源性比對，鉛脅迫的TDF4和TDF7與V型ATP酶G亞基和環(huán)形鋅指蛋白有均75%的同源性。鎘脅迫的TDF11與ABC型轉(zhuǎn)運蛋白家族B亞族和假定的4-α葡聚糖有同源性。鎘脅迫的TDF12與三角狀五肽重復蛋白有同源性。鎘脅迫的TDF14與反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的蛋白質(zhì)有同源性。通過blastn同源性比對，鉛脅迫的TDF6基因與水韭的18S核糖體部RNA基因有100%的同源性。鎘脅迫的TDF9基因與ABC型轉(zhuǎn)運蛋白家族中C亞族的基因有84%的同源性。

3 結(jié)論與討論

本文分離得到的TDF4、TDF7、TDF9均比對出同源性在75%以上的基因，這些基因與重金屬脅迫相關(guān)。其中，鎘脅迫的TDF9與ABC型轉(zhuǎn)運蛋白家族C亞族基因有84%同源性。從cDNA-AFLP電泳圖觀察，屬第Ⅲ類型條帶。該基因在鎘脅迫之前沒有出現(xiàn)，在鎘脅迫以后開始表達。ABC型轉(zhuǎn)運蛋白（ATP-binding cassette transporters），全稱為腺苷三磷酸結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白，是一種跨膜轉(zhuǎn)運器，在其上含有與ATP結(jié)合的框架，通過與ATP的解離和結(jié)合來調(diào)節(jié)物質(zhì)的跨膜運輸[7]。ABC型轉(zhuǎn)運蛋白大部分分布在真核細胞的細胞膜上，少部分分布在線粒體、過氧化物、液泡膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上。ABC型轉(zhuǎn)運蛋白在植物的生命活動有重要的作用，一是將細胞內(nèi)外的異源性化合物和有毒物質(zhì)進行隔離或排出細胞外；二是將植物的次生代謝產(chǎn)物轉(zhuǎn)運到細胞質(zhì)中或區(qū)室化；三是轉(zhuǎn)運植物生長發(fā)育中所需要的信號分子。ABC型轉(zhuǎn)運蛋白家族C亞族（ABCC）是ABC轉(zhuǎn)運蛋白家族中的一個，是ABC型轉(zhuǎn)運蛋白加上了一個疏水性N端，一般相關(guān)報道是以MRP（multidrug resistance-associated protein）命名[8]。MRP亞族全稱為廣譜抗藥性相關(guān)蛋白亞家族，主要存在液泡膜上，在細胞質(zhì)膜上也有存在，其主要功能是將有毒物質(zhì)轉(zhuǎn)運到液泡中，并將有毒物質(zhì)進行螯合，起到對細胞的解毒作用。有研究證明，MRP對受重金屬鎘脅迫的植株有解毒作用[9]。MRP可以充當鎘泵，參與跨液泡膜轉(zhuǎn)運Cd2+螯合物或GS-Cd復合體[10]。有研究表明，大麥在受到200μM鎘脅迫下，有一個與AtMRP3具有同源性的基因上調(diào)表達[11]。還有研究發(fā)現(xiàn)，煙草在受到鎘脅迫的過程中，液泡膜上的AtMRP7基因過量表達，產(chǎn)生的MRP轉(zhuǎn)運蛋白將鎘轉(zhuǎn)運到葉片的液泡中，提高液泡中鎘的含量，從而降低鎘對植物的毒害[12]。TDF9就是鎘脅迫所產(chǎn)生差異表達的基因，而且是在鎘脅迫后開始表達的，通過以上研究者的研究，可以推測中華水韭在受到鎘脅迫時，產(chǎn)生了對鎘響應的基因TDF9，其表達產(chǎn)物的作用是否與MRP一致，還需進一步的試驗加以驗證。

鉛脅迫的TDF4和TDF7與環(huán)形鋅指蛋白（Ring Zinc Finger Protein）有75%同源性。從cDNA-AFLP電泳圖觀察，也屬于第Ⅲ類型的條帶。該基因在鉛脅迫之前沒有出現(xiàn)，在鉛脅迫以后開始表達。環(huán)形鋅指蛋白是一個具有泛素連接酶作用的結(jié)構(gòu)，又叫E3泛素連接酶[13]。它與泛素激活酶E1、泛素結(jié)合酶E2共同作用，將泛素分子標記的靶蛋白進行特異性修飾。這一作用機理可以對細胞周期、增殖、凋亡、分化、轉(zhuǎn)移、基因表達、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、信號傳遞、DNA損傷修等生命活動起到調(diào)控。最新研究表明：擬南芥環(huán)形鋅指蛋白LsRZF1基因可以降低脫落酸的含量及滲透脅迫，并能控制脯氨酸的代謝，從而增強植物對逆境環(huán)境的適應[14]。

目前在國際上，對中華水韭的生理生化過程及形態(tài)發(fā)育研究已取得較多成果，但分子機理方面的研究成果較少。以上這些差異表達基因的發(fā)現(xiàn)將為揭示中華水韭對環(huán)境變化敏感的分子機理奠定基礎(chǔ)。

參考文獻

[1]韓潔.我國今年啟動重金屬污染耕地修復治理[N].新華每日電訊，2014-04-11.

[2]]所芳，賈銳魚.土壤重金屬污染研究現(xiàn)狀[J].中國西部科技，2009（16）：53-55.

[3]葉其剛，李建強.浙江省中華水韭分布現(xiàn)狀與瀕危原因[J].武漢植物學研究，2003，21（3）：216-220.

[4]徐云燕，朱圣朝，莫建軍.中華水韭松陽居群群落結(jié)構(gòu)及其生境特征分析[J].上海交通大學學報，2006，4（24）：358-369.

[5]孫昊，關(guān)旸，劉保東，等.極度瀕危蕨類中華水韭對除草劑的生理響應[J].西北植物學報，2013，33（9）：1830-1837.

[6]黃河，王順利，曹華雯，等.甘菊cDNA-AFLP反應體系的優(yōu)化[J].生物技術(shù)通報，2009.endprint

[7]王華丙，張振義，包銳，等.ABC轉(zhuǎn)運蛋白的結(jié)構(gòu)與轉(zhuǎn)運機制[J].生命的化學，2007，27 （3）：208-210.

[8]邵若玄，沈憶珂，周文彬，等.植物ATP結(jié)合盒（ABC）轉(zhuǎn)運蛋白研究進展[J].浙江農(nóng)林大學學報，2013，30（5）：761-768.

[9]Klein M，Burla B，Martinoia E.The multidrug resistance-associated protein（MRP/ABCC）subfamily of ATP-binding cassette transporters in plants[J].FEBS Letters，2006，580（4）：1112-1122.

[10]陳英旭.土壤重金屬的植物污染化學[M].北京：科學出版社，2008：7.

[11]Schneider T，Schellenberg M，Meyer S，et al.Quantitative detection of changes in the leaf-mesophyII tonoplast proteome in dependency of a cadmium exposure of barely （Hordeum vulgare L.） plants[J].Proteomics，2009，9（10）：2688-2677.

[12]Wojas S，Hennig J，Plaza S，et al.Ectopic expression of Arabidopsis ABC transporter MRP7 modifies cadmium root-to-shoot transport and accumulation[J].Environmental Pollution，2009，157（10）：2781-2789.

[13]戴陽朔，董錚，李魏，等.水稻E3泛素連接酶研究進展[J].作物研究，2013（03）：279-283.

[14]Min J H，Ju H W，Yang K Y et al.Heterologous expression of the gourd E3 ubiquitin ligase gene LsRZF1 compromises the drought stress tolerance in Arabidopsis thaliana[J].Plant Physiology and Biochemistry，2014，77：7-14.

（責編：張宏民）endprint