盧超++張美德++何銀生等

摘要 相關序列擴增多態(tài)性以其多態(tài)性、重復性、穩(wěn)定性較高，易于操作分析、高共顯性、易于分離條帶及測序等優(yōu)點，在植物遺傳育種中得到十分廣泛的應用。分析SRAP標記的原理、特點，對其在重要性狀的基因定位與克隆、QTL作圖、遺傳圖譜構建、種質資源鑒定等方面的應用進行總結，并展望其在植物遺傳育種上的應用前景，以促進SRAP技術的應用推廣。

關鍵詞 SRAP；遺傳育種；研究進展；分子標記

中圖分類號 Q344+.4 文獻標識碼 A 文章編號 1007-5739（2014）16-0018-02

分子標記常用于遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構建、基因作圖和克隆以及植物遺傳育種中的分子標記輔助選擇。根據(jù)檢測分析的方法，大部分分子標記可以歸類為基于雜交或者PCR反應的方法。RFLP是第1個基于雜交的分子標記系統(tǒng)，并在當時被廣泛應用于生命科學的研究。而諸如微陣列和多樣性序列芯片技術（DArT）是目前用于檢測單核苷酸多態(tài)性的主要技術，其也是基于雜交的分子標記方法。同時，很多基于PCR的分子標記方法被開發(fā)出來，這些標記包括AFLP、RAPD、SSR、SRAP、ISSR以及SCAR等，通常用于基因組分析。這些分子標記分析技術并不完美，都存在一些技術上的局限性。例如，RFLP標記的探針在相關的物種中通用性比較好，在比較基因組學應用方面相對其他的標記有很大的優(yōu)勢。但是，RFLP在檢測程序方面過于復雜并且成本高，不易進行成千上萬個體的自動化分析用于分子標記輔助選擇。

SRAP分子標記是由加州大學的Li和Quiros[1]博士于2001年共同開發(fā)出來的，目的是為了擴增開放閱讀框，通常又被稱作基于序列擴增多態(tài)性（SBAP）[2]。作為一種新型基于 PCR的標記系統(tǒng)，根據(jù)基因外顯子里GC含量豐富而啟動子和內含子里AT含量豐富的特點來設計引物進行擴增，因不同個體的內含子、啟動子與間隔區(qū)長度不等而產生多態(tài)性。由于SRAP標記具有較多的優(yōu)點，如中等產量、簡便、重復性、高共顯性、易于分離條帶及測序等，且在基因組中均勻分布，已廣泛應用于常規(guī)作物如小麥、水稻、棉花、油菜以及模式植物擬南芥的基因克隆與定位、種質資源鑒定、遺傳圖譜構建等生物學研究。

1 SRAP技術的原理與特點

1.1 SRAP標記的引物設計原理

SRAP標記分析中共有2套引物，這些引物通常為17或者18個堿基長度并含有以下一些元件：首先是長度為13～14 bp核心序列元件，其5′端為10～11 bp的非特異性填充序列，緊隨其后的為CCGG（正向引物）或者AATT（反向引物）。核心序列后面為3個選擇性堿基，這3個堿基的變化能產生一系列引物，它們有著共同的核心序列。引物設計的原則為正向和反向引物的填充序列在組成上必須不同，長度為10～11 bp，引物之間不能形成發(fā)夾結構或其他的二級結構，GC的含量在40%～50%。

正向引物中的CCGG序列可以特異性結合ORF區(qū)域中的外顯子，而反向引物中的AATT序列特異結合于富含AT區(qū)的內含子和啟動子。這樣正反向引物結合可以同時對外顯子、內含子和啟動子區(qū)域進行特異性擴增，并且因為個體不同及物種的內含子、啟動子和間隔序列不同而產生多態(tài)性[3]。

1.2 SRAP擴增程序及檢測方法

目前，SRAP標記采用復性變溫法擴增，主要有以下2種方法，第1種：由Li等在2001年建立，即94 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min，35 ℃復性1 min，72 ℃延伸1 min，循環(huán)5次；94 ℃變性1 min，50 ℃復性1 min，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；最后72 ℃延伸5～10 min；4 ℃保存。前5個循環(huán)采用較低的退火溫度，有利于引物與靶序列更好的結合，隨后的35個循環(huán)采用50℃退火溫度，以保證擴增產物以指數(shù)方式進行有效的擴增。第2種：由Budak等[4]提出，反應條件基本不變，但反應退火溫度保持47 ℃。2種方法均可得到穩(wěn)定性和重復較好的擴增產物?？筛鶕?jù)試驗目的、材料進行優(yōu)化調整，以獲得較佳的試驗效果。擴增產物一般用4%～6%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，可用銀染技術檢測或同位素標記，也可用1.8%～2.0% 瓊脂糖凝膠電泳分析多態(tài)性，但分辨率比較低。

2 SRAP技術在植物遺傳育種中的研究進展

2.1 遺傳圖譜構建

遺傳圖譜已廣泛應用于基因作圖、QTL作圖以及全基因組序列的拼接組裝。在大多數(shù)應用中，高密度分子標記遺傳圖譜的構建是必要的且具有很大優(yōu)勢。通過對SRAP引物熒光標記，SRAP-PCR反應能夠實現(xiàn)多位點檢測的自動化分析，因此使用SRAP技術構建高密度遺傳圖譜是可行的。

在甘藍型油菜中，Sun等人利用‘6-FAM、‘VIC、‘Pet、‘NED以及‘LIZ五色熒光染料，使用ABI的遺傳分析儀進行SRAP分析[5]。以‘LIZ作為內參，而其他4種熒光染料被用來標記SRAP引物，然后和未標記的引物組合在一起。在使用4個熒光標記和4個未標記的引物擴增得到SRAP產物后，來自4個SRAP引物組合的擴增產物被混合到一起，從而使檢測通量增加了4倍。從12個熒光標記和442個未熒光標記的SRAP引物中選取了1 634個SRAP引物組合擴增得到13 472個SRAP標記。連同79個SSR標記的結果，構建了目前最為飽和的甘藍型油菜遺傳圖譜。Li等人采用cDNA-SRAP技術，首先構建了基于甘藍型油菜葉片組織cDNAs的轉錄圖譜[6]。在cDNA-SRAP技術中，通過逆轉錄酶合成第一鏈cDNA后，一步法PCR能夠擴增單鏈cDNAs。由于大多數(shù)的cDNA-SRAP標記來源于基因序列間的差異，所以這些標記通常被認為是功能標記。SRAP的擴增產物很容易通過聚丙烯酰胺凝膠分離出來進行測序，因此Li等人對190個分離的片段進行測序，這些片段對應了cDNA-SRAP的190個多態(tài)性位點。通過序列相似性分析，發(fā)現(xiàn)其中的169個序列片段同擬南芥中報道的基因具有同源性，這就允許根據(jù)基因對基因的比對來鑒定2個物種基因組間廣泛的共線性。endprint

SRAP分子標記技術也常常與其他的分子標記相結合來構建遺傳圖譜。在葫蘆科植物中，Yeboah等人采用SRAP和ISSR雙標記構建了黃瓜的遺傳圖譜[7]。他們通過對2個二倍體親本的雜交培育出了假測交F1分離群體，然后用164個SSR標記和108個SRAP標記一起分別構建了父本和母本的遺傳圖譜。Zhang等人在黃瓜亞種間作圖群體里構建了一個高密度共有遺傳圖譜。該圖譜包含了超過1 000個的分子標記，其中有1 152個SSR標記，192個SRAP標記，21個SCAR標記以及1個STS標記[8]。對于多態(tài)性較低的物種，采用多個標記對于構建覆蓋全基因組的高密度遺傳圖譜是很有必要的。

2.2 QTL作圖

遺傳圖譜通常用于復雜性狀的的QTL作圖。由于QTL一般是由基因組中多基因所支撐，一般很難用標記孟德爾位點的方法來標記QTL。通常，如果一個復雜性狀能夠被轉換為一個簡單的孟德爾性狀，那么就有很多種策略可以用于孟德爾化基因的作圖和克隆。事實上，大多數(shù)QTL的克隆是通過培育近等基因系的孟德爾化方法完成的。但是，大多數(shù)的QTL不太容易孟德爾化，因此首先構建遺傳圖譜，然后進行QTL作圖是很有必要的。

在油菜中，Chen等人采用SRAP和SSR標記在一個DH群體中構建了遺傳圖譜，該群體是由一個黃籽油菜品系和一個傳統(tǒng)的油菜品系通過小孢子培養(yǎng)培育而成[9]。該研究采集了包括開花天數(shù)、含油量以及種子產量的3個復雜性狀在3個地點3年的數(shù)據(jù)并用于QTL作圖。對于含油量，在14個連鎖群鑒定了27個QTL；對于籽粒產量，在11個連鎖群鑒定了18個QTL；而對于開花天數(shù)，該研究表明，開花天數(shù)在作圖群體中是由單基因位點控制。Xu等人利用592個分子標記，其中包括287個SRAP標記、135個RAPD標記、78個SSR標記、49個ISSR標記、29個RAMP標記、14個RGA標記，在蘿卜中構建了一個遺傳圖譜[10]。利用這個遺傳圖譜進行控制根部鎘積累的QTL分析，在1、4、6和9 4個連鎖群定位了4個QTL位點。在連鎖群9上的QTL是主要的一個，占表型變異的48.64%，暗示該QTL可以用于分子標記輔助選擇，從而通過減低重金屬鎘的含量來改善蘿卜根部品質。

2.3 種質資源鑒定

劉 強等以17個水稻雜交種種子為試驗材料，共組配25對SRAP引物組合進行分析，篩選出12對條帶穩(wěn)定、多態(tài)性較好的引物組合[11]。利用這些引物組合進行水稻雜交種鑒定，結果發(fā)現(xiàn)引物組合ME-6/EM-5產生15條多態(tài)性帶，可把17個雜交種區(qū)分為11類，引物組合ME-1/EM-2能把17個雜交種區(qū)分為11類。引物組合ME-1/EM-3在17個雜交種間的多態(tài)性最好，共產生清晰可見的譜帶28條，其中清晰可見的多態(tài)性片段21條，可把17個雜交種區(qū)分為17類。因此，SRAP技術可以較好的區(qū)分水稻雜交種，其結果比較準確可靠。劉澤發(fā)等人以印度南瓜品種雜交種子為試驗材料，應用限制性位點擴增多態(tài)性（RSAP）標記、相關序列擴增多態(tài)性（SRAP）標記鑒定其純度[12]。發(fā)現(xiàn)篩選出的引物R1R7、E1M5能夠很好地區(qū)分出錦栗二號、紅栗、紅栗二號、錦栗南瓜品種，利用RSAP分子標記R1R7可檢測出錦栗雜交種子純度，分子標記檢測結果與田間檢測結果吻合率達90%。

2.4 重要性狀的基因定位與克隆

SRAP技術在基因定位方面有一定的優(yōu)勢。由于SRAP可以使用無限的引物組合進行檢測并且單個SRAP-PCR反應就可以檢測多個位點，因此在基因定位方面SRAP技術相對于其他分子標記方法具有很大的優(yōu)勢地位。在基因組中當多個基因位點被快速篩選出來后，與目標性狀緊密連鎖的SRAP標記能夠很容易地被鑒定出來。

在一些研究中，SRAP標記常被用于一些農作物抗病性基因的定位。Chen等人利用SSR、SRAP以及TRAP標記進行了小麥抗條銹病基因的定位研究[13]。該研究使用400個SSR引物、315對SRAP引物以及40對TRAP引物來篩選F1、F2以及BC1作圖群體，從而構建了一個精細的圖譜，該圖譜將抗性基因位點定位于染色體臂2AS側翼并且表明該抗性基因屬于新發(fā)現(xiàn)的抗性基因。在水稻中，Zhao等人搜索與一個水稻抗條紋葉枯病毒顯性基因（RSV1）相連鎖的SSR標記，隨后又使用SRAP技術去尋找緊密連鎖的分子標記，最終將RSV1定位到了兩翼為SSR和SRAP標記的區(qū)域[14]。

3 問題與展望

理論上，分子標記應該具有多態(tài)性、穩(wěn)定性較好，在整個基因組中均勻分布的優(yōu)點，操作步驟簡單。但是，目前還沒有一種分子標記技術同時具備以上優(yōu)點。SRAP標記也同樣沒有兼具以上的各種優(yōu)點，主要原因就在于該技術是對ORFs擴增，而著絲粒附近以及端?；蚪M相對較少，導致擴增較少，若結合使用可擴增這些區(qū)域的SSR標記技術，以獲得覆蓋整個基因組的連鎖圖譜。

總之，SRAP作為一種簡單有效的方法在植物遺傳育種中應用廣泛。在與其他分子標記技術綜合應用，能更加有效的構建高密度遺傳圖譜，從而在種質資源鑒定、遺傳多樣性分析、基因的克隆與定位等方面進行研究，以期在植物遺傳育種研究中發(fā)揮更大的作用。

4 參考文獻

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