朱劉影+張健+劉倩倩+徐悅+馬媛媛+謝逸萍+劉美艷

摘要：利用甘薯黑斑病菌的孢子懸液誘導(dǎo)甘薯塊根幾丁質(zhì)酶活性。結(jié)果表明，黑斑病浸染使甘薯塊根幾丁質(zhì)酶活性上升，抗病品種南京-92塊根內(nèi)幾丁質(zhì)酶活性比感病品種煙臺-252提高速度快、活性高、保持時間長，有利于抵抗病原菌的侵害。體外抑菌試驗顯示幾丁質(zhì)酶液對甘薯黑斑病菌具有較強(qiáng)的抑制作用。核黃素和脫乙酰幾丁質(zhì)處理均能誘導(dǎo)甘薯塊根幾丁質(zhì)酶活性提高。

關(guān)鍵詞：甘薯；黑斑??；幾丁質(zhì)酶；核黃素；脫乙酰幾丁質(zhì)

中圖分類號：S435.313+.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2014）08-0106-03

甘薯（Ipomoea batatas）是僅次于水稻、小麥和玉米的重要糧食作物，甘薯葉被世界衛(wèi)生組織確定為最佳蔬菜^[1]。甘薯產(chǎn)乙醇能效高、無污染，是生物能源的理想材料之一。甘薯黑斑病（Ceratocystis fimbriata Ellis et Halsted）是危害甘薯的主要病害，在甘薯的種植和儲藏過程中均有發(fā)生^[2]。目前對于甘薯抗黑斑病的研究多集中在篩選抗病品種和雜交育種方面^[3]，對于甘薯抗黑斑病機(jī)制方面的報道很少^[4-5]，研究也不深入。植物病程相關(guān)蛋白（pathogenesis-related protein，PRs）是植物體內(nèi)被病原菌等刺激物刺激產(chǎn)生的一類蛋白質(zhì)，正常情況下含量并不高，一旦被誘導(dǎo)，含量迅速增加，從而提高植物對病蟲害等逆境的防御能力^[6]。植物幾丁質(zhì)酶被認(rèn)為是一類與植物抗病有著密切關(guān)系的病程相關(guān)蛋白。它參與了植物體內(nèi)防御機(jī)制^[7-8]，在外界刺激物的刺激下可使植物體內(nèi)本身含量較少的酶迅速積累。誘導(dǎo)物分為兩大類，一類為生物性的刺激物，包括細(xì)菌、真菌、病毒類或者真菌細(xì)胞壁降解物^[9-10]，另一類為非生物性的刺激物，包括機(jī)械損傷、蟲傷、脫乙酰幾丁質(zhì)、乙烯、水楊酸、紫外光、重金屬鹽等。通過誘導(dǎo)物來誘導(dǎo)甘薯幾丁質(zhì)酶含量上升和活性提高的研究未見報道。本試驗研究了核黃素和脫乙酰幾丁質(zhì)對甘薯塊根幾丁質(zhì)酶誘導(dǎo)作用，旨在為生產(chǎn)上防治甘薯黑斑病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試甘薯品種為南京-92（高抗黑斑?。┖蜔熍_-252（高感黑斑?。?，甘薯黑斑病病原物，均由中國農(nóng)科院甘薯研究中心提供。

1.2 方法

1.2.1 黑斑病菌孢子懸液的制備 黑斑病菌孢子懸液的制備按照王景景等的方法^[4]進(jìn)行。

1.2.2 薯塊接種 選取兩個品種正常無病斑的薯塊，用自來水沖洗干凈，再放入0.1%的次氯酸鈉溶液中，表面消毒 10 min，用蒸餾水沖洗3次。將塊根切成約1.0 cm厚的圓片，將0.1 mL黑斑病菌內(nèi)分生孢子懸液涂在塊根圓片的表面，放置于28 ℃恒溫箱中培養(yǎng)，以蒸餾水涂抹塊根圓片的作為對照組。

1.2.3 幾丁質(zhì)酶的提取和活性測定 分別取兩個品種染菌后的甘薯塊根各0.5 g，加4 mL 0.02 mol/L 乙酸-乙酸鈉緩沖液（pH 5.5），冰浴研磨，定容至5 mL，4 ℃ 8 000 r/mi，離心15 min，上清液為待測酶液。幾丁質(zhì)酶活力測定參照Boller等方法^[11]進(jìn)行。酶活定義：以每小時分解膠體幾丁質(zhì)產(chǎn)生 1 μmol N-乙酰氨基葡萄糖的酶量為1個酶活力單位（U/mL）。

1.2.4 甘薯幾丁質(zhì)酶體外抑菌試驗

采用瓊脂擴(kuò)散法來檢測甘薯幾丁質(zhì)酶體外抑菌的效果^[12]。PDA培養(yǎng)基冷卻后，用滅菌后直徑 7 mm的打孔器在平板上均勻打出6個孔洞。用無菌牙簽挑出瓊脂柱。在每個孔中加入少量未凝固的PDA封住孔底部，約2 mm厚度。然后將20 μL無菌酶液以及稀釋成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5 的酶液分別加入孔中，最后用新的滅菌后的打孔器在活化好的待試菌種培養(yǎng)基上打一個菌餅，將其倒貼于加過菌液的培養(yǎng)基正中央，28 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)4 d。通過比較病斑大小來判定幾丁質(zhì)酶的抑菌效果。檢測對象為甘薯黑斑病菌、小麥赤霉病菌、水稻紋枯病菌。

1.2.5 核黃素和脫乙酰幾丁質(zhì)處理

脫乙酰幾丁質(zhì)原液的制備按王榮娟^[13]的方法進(jìn)行。

將3 mL核黃素（1 mmol/L）和脫乙酰幾丁質(zhì)（1 mg/mL）均勻涂抹在薯塊的表面，然后將薯塊放入培養(yǎng)皿中，30±1 ℃暗箱中保溫。試驗各處理均設(shè)3次重復(fù)。數(shù)據(jù)采用SPSS Statistics軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。P<0.05（用*表示）為顯著性差異，P<0.01（用**表示）為極顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑斑病侵染對不同抗性甘薯塊根幾丁質(zhì)酶活性的影響

黑斑病對2種不同抗性甘薯塊根內(nèi)幾丁質(zhì)酶活性的影響見圖1。從圖1可以看出，未接種黑斑病菌時，南京-92和煙臺-252塊根中幾丁質(zhì)酶活性差異不顯著。接菌后2個品種幾丁質(zhì)酶活性上升，于接菌后6 d達(dá)到最大值，而高抗品種南京-92塊根幾丁質(zhì)酶活性增加速度高于高感品種煙臺-252。差異分析表明，染菌4 d和8 d時南京-92塊根幾丁質(zhì)酶活性顯著高于煙臺-252，2 d和6 d時兩甘薯品種幾丁質(zhì)酶活性差異極顯著。

2.2 甘薯幾丁質(zhì)酶對3種真菌的抑制作用

檢測了甘薯幾丁質(zhì)酶對甘薯黑斑病菌、小麥赤霉病菌和水稻紋枯病菌的抑制作用（圖2）。通過比較抑菌圈的大小可以看出：甘薯幾丁質(zhì)酶液（100）和稀釋成10-1、10-2、 10-3、10-4、10-5 的酶液對甘薯黑斑病菌（圖2-A）有較明顯的抑制作用，對小麥赤霉病菌（圖2-B）和水稻紋枯病菌（圖2-C）的抑制作用較小。

2.3 核黃素對不同抗性甘薯幾丁質(zhì)酶活性的影響

經(jīng)核黃素處理后，2種不同抗性甘薯塊中幾丁質(zhì)酶活性均呈現(xiàn)升高的趨勢（圖3）。高抗品種南京-92幾丁質(zhì)酶活性的上升幅度比高感品種煙臺-252大，且在整個處理期間南京-92幾丁質(zhì)酶活性高于煙臺-252。處理4 d和6 d時，南京-92幾丁質(zhì)酶活性是煙臺-252的213.9%和175%。顯著性分析表明，處理2 d和8 d時2個甘薯品種幾丁質(zhì)酶活性差異顯著；處理4 d和6 d時2個甘薯品種幾丁質(zhì)酶活性差異極顯著。

2.4 脫乙酰幾丁質(zhì)對不同抗性甘薯幾丁質(zhì)酶活性的影響

脫乙酰幾丁質(zhì)能提高甘薯幾丁質(zhì)酶的活性（圖4）。比較2個抗性不同甘薯品種幾丁質(zhì)酶活性的變化可以看出，南京-92幾丁質(zhì)酶活性的上升速度快且活性高于高感品種煙臺臺-252的221.9%和158.9%。顯著性分析表明，處理2 d時2個甘薯品種幾丁質(zhì)酶活性差異顯著；處理4 d、6 d和8 d時2個甘薯品種幾丁質(zhì)酶活性差異極顯著。

3 討論

幾丁質(zhì)是真菌細(xì)胞壁的主要成分，幾丁質(zhì)酶的底物為幾丁質(zhì)，因此植物幾丁質(zhì)酶能夠直接降解真菌細(xì)胞壁，抑制真菌孢子萌發(fā)和菌絲生長，從而達(dá)到抑制真菌病害的作用^[14]。本試驗結(jié)果驗證了甘薯幾丁質(zhì)酶是一種誘導(dǎo)酶^[15-16]。未感染黑斑病時，高抗和高感薯塊內(nèi)幾丁質(zhì)酶活性都很低，并且差異不顯著；受黑斑病菌感染后，兩個品種薯塊能夠迅速積累幾丁質(zhì)酶來水解黑斑病菌的細(xì)胞壁，抑制菌絲的生長，高抗品種甘薯塊內(nèi)的幾丁質(zhì)酶比高感品種積累的量多，幾丁質(zhì)酶活性在處理 2 d 和6 d時達(dá)到極顯著差異，說明幾丁質(zhì)酶對于甘薯抵抗黑斑病的侵染具有重要作用。抑菌試驗進(jìn)一步證明了甘薯幾丁質(zhì)酶對甘薯黑斑病有較強(qiáng)的抑制作用。

幾丁質(zhì)酶是重要的病程相關(guān)蛋白，能夠分解β-1，4鍵形成的線性幾丁質(zhì)，幾丁質(zhì)酶活性能夠在抗性誘導(dǎo)過程中顯著增強(qiáng)^[17]。研究表明，核黃素作為非?；ぐl(fā)子可以誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)獲得抗病性^[18]。脫乙酰幾丁質(zhì)主要存在于海洋生物、昆蟲的甲殼中，研究表明，脫乙酰幾丁質(zhì)能誘導(dǎo)植物提高抗病性[13，19]。本研究結(jié)果表明，核黃素和脫乙酰幾丁質(zhì)處理能提高甘薯塊根幾丁質(zhì)酶活性，高抗品種酶活性高于高感品種，幾丁質(zhì)酶活性的上升有助于提高甘薯對黑斑病的抵抗能力。這與以玉米、番茄、蘋果為試驗材料的結(jié)果一致^[20-21]。本研究結(jié)果為生產(chǎn)上防治甘薯黑斑病提供了一種可行的方法。

參考文獻(xiàn)：

[1]蔡自建，闞建全，陳宗道.甘薯營養(yǎng)研究進(jìn)展[J]. 四川食品與發(fā)酵，2003，39（3）：48-51.

[2]謝一芝，邱瑞鐮，戴起偉，等. 甘薯抗黑斑病育種研究進(jìn)展[J]. 國外農(nóng)學(xué)：雜糧作物，1997（2）：22-24.

[3]趙冬蘭，張允剛，唐 軍，等. 抗甘薯黑斑病優(yōu)異種質(zhì)資源的篩選與評價[J]. 植物遺傳資源學(xué)報，2005，6（1）：80-83.

[4]王景景，劉美艷，謝逸萍，等. 黑斑病對甘薯葉酚類物質(zhì)含量、PPO及PAL活性的影響[J]. 廣西植物，2012，32（3）：406-409.

[5]劉美艷，孫厚俊，王景景，等. 甘薯塊根抗黑斑病酚類物質(zhì)代謝研究[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報，2012，28（24）：226-230.

[6]彭霞薇，趙哀梅，白志輝，等. 果膠酶激發(fā)子對黃瓜葉片病程相關(guān)蛋白及細(xì)胞壁物質(zhì)的影響[J]. 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報，2006，12（3）：325-328.

[7]邱永祥，柯玉琴，代紅軍，等. 甘薯抗蔓割病的酚類物質(zhì)代謝的研究[J]. 中國生態(tài)農(nóng)業(yè)學(xué)報，2007，15（5）：167-170.

[8]莊炳昌，王玉民. 抗性不同大豆品種感染灰斑病后若干生化變化[J]. 作物學(xué)報，1993，19（6）：567-569.

[9]于漢壽，張益民，陳永萱，等. 油菜幾丁質(zhì)酶的純化及其在抗菌核病中的作用[J]. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，1999，22（3）：41-44.

[10]陳崇順，朱雪峰，郁志芳. 豇豆幾丁質(zhì)酶的誘導(dǎo)與純化[J]. 園藝學(xué)報，2000，27（5）：351-355.

[11]Boller T，Gehria A，Mauch F，et al. Chitinase in bean leaves：induction by ethylene，purification，properties，and possible function[J]. Planta，1983，157：22-31.

[12]楊 建，林麗飛，陳紹興，等. 大黃藤內(nèi)生放線菌分離及抗菌活性初步研究[J]. 紅河學(xué)院學(xué)報，2010，8（2）：49-53.

[13]王榮娟，姚允聰，戚亞平，等. 蘋果脫乙酰幾丁質(zhì)發(fā)酵液誘導(dǎo)蘋果葉片對斑點落葉病的早期抗性反應(yīng)[J]. 生態(tài)學(xué)報，2012，32（7）：2239-2247.

[14]馬匯泉，甄惠麗，孫偉萍. 幾丁質(zhì)酶及其在抗植物真菌病害中的作用[J]. 微生物學(xué)通報，2004，24（3）：50-53.

[15]汪少蕓，李邦德，吳金鴻，等. 綠豆幾丁質(zhì)酶的純化與酶學(xué)性質(zhì)分析[J]. 福州大學(xué)學(xué)報，2004，32（6）：769-772.

[16]黃 璟，?，F(xiàn)周. 乙烯利和乙烯刺激對橡膠樹膠乳中幾丁質(zhì)酶活性和膠乳產(chǎn)量的影響[J]. 熱帶作物學(xué)報，2003，24（4）：1-5.

[17]Zhu Y J，Qiu X H，Moore P H，et al. Systemic acquired resistance induced by BTH in papaya[J]. Physiol Mol PlantPathol，2003，63：237-248.

[18]Zhang S J，Yang X，Sun M W，et al. Riboflavin-induced priming for pathogen defense in Arabidopsis thaliana[J]. Journal of Integrative Plant Biology，2009，51：167-174.

[19] Hu X Y，F(xiàn)ang J Y，Ca W M. Oxidative burst and saponin synthesized in ginseng cells induced by deacetylation of chitin were mediated by Mitogenactivated protein kinase[J]. Science in China，2004，34（1）：31-40.

[20]易承波，葉華智. 外源化學(xué)物質(zhì)對玉米抗彎孢菌葉斑病的誘導(dǎo)作用[J]. 植物保護(hù)，2005，31（5）：31-35.

[21]黑銀秀，朱為民，郭世榮，等. 核黃素和接種番茄黃化曲葉病毒對番茄幾丁質(zhì)酶和β-1，3-葡聚糖酶活性的影響[J]. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2012，35（4）：135-139.