陳湘燕,張 盈,秦立新,伍貴方,段婷婷*
(1.貴州省植物保護研究所,貴州 貴陽550006,2.黔南州農(nóng)業(yè)委員會,貴州 都勻558000)
環(huán)酰菌胺(Fenhexamid)和噻酰菌胺(Tiadinil)是新型酰胺類內(nèi)吸性殺菌劑,主要用于大田作物、蔬菜、果樹等病害的防治[1-2],并且對已產(chǎn)生抗藥性的抗性菌亦有防效,由于二者低毒,無致畸形,所以使用范圍在逐漸擴大。關于這兩種農(nóng)藥在蔬菜、動物源性食品、水果等中的殘留檢測方法分別有報道,測定的主要方法有酶聯(lián)免疫法(ELISA)、高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜法(NPD)、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[3-10]。目前,歐盟制定了環(huán)酰菌胺在水稻中的最大殘留限量(MRL)是0.05 mg/kg;韓國和日本規(guī)定噻酰菌胺在稻米中的MRL值是1 mg/kg,其他國家和組織沒有制定環(huán)酰菌胺和噻酰菌胺在稻米中的MRL值。在我國,環(huán)酰菌胺和噻酰菌胺作為防治水稻稻瘟病的藥劑在推廣使用,但在水稻生態(tài)系統(tǒng)中檢測這兩種藥劑的殘留分析方法未見報道。
超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLCMS/MS)測定,結(jié)合基質(zhì)固相分散萃取技術凈化,是一種同時具備高效率、高特異性和高靈敏度的普適性方法,廣泛用于農(nóng)藥及環(huán)境污染物的殘留分析測定[11]。本文建立了采用分散固相萃?。璘PLC-MS/MS法同時測定稻田生態(tài)系統(tǒng)中環(huán)酰菌胺和噻酰菌胺殘留分析檢測方法,為水稻的安全生產(chǎn)以及稻田生態(tài)系統(tǒng)中相應的農(nóng)藥殘留量的檢測和確證提供依據(jù)。
環(huán)酰菌胺(99.5%)標準品,噻酰菌胺(99%)標準品(北京勤誠亦信科技開發(fā)有限公司);乙腈(色譜純、分析純);水(Milli-Q超純水);N-丙基乙二胺(PSA,Agela Technologies公司);石墨化碳黑(GCB,德國CNW Technologies GmbH公司);超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS,TSQVantage,Thermo公司);Hypersil GOLD色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.9μm,Thermos公司),HR 1727/06/BC飛利浦粉碎機(珠海飛利浦家庭電器有限公司);SK-1漩渦混合器(江蘇中大儀器廠);TG16臺式離心機(長沙邁佳森儀器設備有限公司);Filter Unit濾膜(0.22μm,Agela Technologies公司)。
用電子天平分別準確稱取環(huán)酰菌胺標準品(99.5%)0.010 0 g和噻酰菌胺標準品(99.0%)0.010 1 g(精確到0.000 1 g),用色譜純乙腈溶解并定容至100 mL,配制成質(zhì)量濃度為100 mg/L的儲備液,于4℃冰箱中保存。準確移取適量儲備液,分別用色譜純乙腈稀釋成2、1、0.5、0.05、0.005 mg/L的系列標準品溶液。
土壤除去根、雜物,稻谷脫殼,稻米、稻殼和稻稈用高速萬能粉碎機24 000 r/min打碎,混勻。
1.3.1 提取 稻田土、稻田水:準確稱取10.0 g樣品于50 mL具塞離心管中;加入10 mL乙腈,渦旋3 min,加入1 g氯化鈉和4 g無水硫酸鎂,渦旋1 min,以4 000 r/min離心5 min,取上清液待凈化。
稻米、稻殼、稻稈:準確稱取5.0 g樣品于50 mL具塞離心管中,加入5 mL水,渦旋30 s;加入10 mL乙腈,渦旋3 min,加入1 g氯化鈉和4 g無水硫酸鎂,渦旋1 min,以4000 r/min離心5 min,取上清液待凈化。
1.3.2 凈化 稻田土、水、稻米:取1.5 mL上清液,加入到盛有150 mg無水硫酸鎂、50 mg PSA的2 mL離心管中,渦旋1vmin,以5 000 r/min離心5 min,取上清液,過0.22μm有機膜,待進樣。
稻殼、稻稈:取1.5 mL上清液,加入到盛有150 mg無水硫酸鎂、50 mg PSA和10 mg GCB的2 mL離心管中,渦旋1 min,以5 000 r/min離心5 min,取上清液,過0.22μm有機膜,待進樣。
1.4.1 色譜條件Hypersil GOLD色譜柱;柱溫:40℃;流動相A為甲醇,流動相B為水溶液,二元梯度洗脫:0~0.2 min,20%A;0.2~0.5 min,20%~90%A;0.5~2.8 min,90%A;2.8~3.5 min,90%~60%A,3.5~5.0 min,60%~20%A,5.0~6.0 min,20%A;流速:0.25 mL/min;進樣量:2μL。
1.4.2 質(zhì)譜條件 大氣壓化學電離ESI-方式掃描方式,毛細管溫度350℃;電噴霧電壓2 800 V;鞘氣及輔助氣是氮氣,鞘氣流速30 arb,輔助氣流速10 arb;碰撞氣為氬氣。環(huán)酰菌胺S-leans射頻電壓45 V,定性離子對300.2/249.2,定量離子對300.2/264.2,碰撞能量分別為33 V和22 V。噻酰菌胺S-leans射頻電壓46 V,定性離子對266.2/239.2,定量離子對266.2/71.0,碰撞能量分別為13 V和15 V。
基質(zhì)效應(Matrix effects)是LC/MS進行生物樣品測定時常常產(chǎn)生的現(xiàn)象?;|(zhì)效應影響大時會降低方法的靈敏度,影響方法的準確性[12]。本文對目標化合物中存在的基質(zhì)效應進行了研究。分別準確吸取系列環(huán)酰菌胺和噻酰菌胺混合標準溶液(20、10、5、0.5、0.05 mg/kg)100μL,氮吹至干,準確加入1 mL按1.2.3步驟的各種空白溶液,即得基質(zhì)標準溶液。2、1、0.5、0.05、0.005 mg/L的系列溶劑標準品溶液和基質(zhì)標準溶液在1.2.4分析條件下進樣,以環(huán)酰菌胺和噻酰菌胺的質(zhì)量濃度為橫坐標,以它對應的峰面積為縱坐標作圖。經(jīng)最小二乘法擬合得溶劑標準曲線和各基質(zhì)標準曲線線性方程(表1)。其線性范圍在0.005~2 mg/L之間。
方法的準確度、精密度和靈敏度分別用添加回收率、變異系數(shù)和最低檢出量(LOD)與最低定量限(LOQ)衡量。在稻田土、稻田水、稻米、稻殼和稻稈的空白樣品中分別準確加入環(huán)酰菌胺和噻酰菌胺的混合標準液,使其分別相當于0.005、0.05、0.5、1.0和2.0 mg/kg的添加水平。按照1.3中所述步驟進行提取、凈化,1.4條件下測定,5次重復,計算平均回收率和相對標準偏差。LOD以最低添加水平的色譜圖中噪音信號的三倍計算,LOQ以最低添加濃度表示。
目前對于環(huán)酰菌胺和噻酰菌胺主要方法有酶聯(lián)免疫法、高效液相色譜法、氣相色譜法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法。液相色譜法、氣相色譜法的前處理過程復雜,多采用液液分配和固相萃取來凈化,使用的有機溶劑多,對環(huán)境造成二次污染。液相色譜法雜質(zhì)干擾嚴重,靈敏度低,且屬非選擇性檢測,遇到復雜樣品可能出現(xiàn)假陽性。氣相色譜法因氣化和高溫易導致農(nóng)藥降解不足,檢出限高、檢測時間長。酶聯(lián)免疫法主要用于醫(yī)學和食品檢定。超高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法現(xiàn)今已廣泛地應用于農(nóng)作物及食品中殘留物質(zhì)的分析檢測,它操作簡單,靈敏度高,選擇性強,定量準確,線性范圍寬。
為了獲得最佳的靈敏度和分離效果,采用直接進樣方式,掃描范圍m/z為200~600,選擇合適的離子源和流動相。實驗結(jié)果表明,在1.4所示的選擇監(jiān)控離子、S-leans射頻電壓及碰撞能量下,電噴霧離子化、負離子掃描模式可使環(huán)酰菌胺和噻酰菌胺具有較好的電離效果并獲得特征離子峰[MH]。在此基礎上進一步選擇質(zhì)譜參數(shù),選擇最適的監(jiān)測離子、S-leans射頻電壓及碰撞能量。采用甲醇和水體系為流動相,在1.4.1條件下梯度洗脫,可得到較高的靈敏度、重現(xiàn)性及峰形。
本實驗樣品凈化過程,主要采用PSA去除基質(zhì)中的干擾雜質(zhì)。但水稻植株和稻殼樣品含有大量色素,僅使用PSA,其凈化效果不佳,因此在PSA凈化基礎上,加入了適量的石墨化碳黑輔助凈化。結(jié)果表明,采用PSA和石墨化碳黑混合凈化劑在處理水稻植株和稻殼樣品,能取得理想的凈化效果。且在獲得較好回收率的同時,獲得了較好的重現(xiàn)性,簡化了操作程序,提高了效率。
采用基質(zhì)匹配標準曲線斜率和溶劑標準曲線斜率之比(K)來評價基質(zhì)效應:當K在0.9~1.1之間時,基質(zhì)效應不明顯,當K大于1.1時為基質(zhì)增強效應,小于0.9則是基質(zhì)減弱效應[13]。由表1可知,環(huán)酰菌胺和噻酰菌胺的稻田土、稻米、稻殼和稻桿基質(zhì)標準曲線與溶劑標準曲線的斜率比(K)小于0.9,屬于基質(zhì)減弱效應,而稻田水基質(zhì)標準曲線與溶劑標準曲線的斜率比(K)在0.9和1.1之間,則環(huán)酰菌胺和噻酰菌胺在稻田水基質(zhì)中的基質(zhì)效應不明顯。為保證方法的通用性和適用性,本文通過基質(zhì)匹配標準樣液校正消除基質(zhì)效應影響。
表1 環(huán)酰菌胺和噻酰菌胺(0.005~2 mg/L)的線性方程、相關系數(shù)和方法檢測限Tab.1 The linear equations(0.005~2 mg/L),correlation coefficients and LOD of fenhexamid and tiadinil
由表2可見經(jīng)基質(zhì)匹配標準品校正后環(huán)酰菌胺和噻酰菌胺在稻田土、稻田水、稻米、稻殼和水稻稈中的平均回收率為81.9%~107.6%,變異系數(shù)為1.4%~9.6%,表明本方法有較好的準確度和精密度可以滿足殘留定量分析的要求。添加色譜圖見圖1。
圖1 環(huán)酰菌胺和噻酰菌胺在樣品中的總離子流圖(a:噻酰菌胺總離子流圖;b:環(huán)酰菌胺總離子流圖)Fig.1 Total ion Chromatograms of fenhexamid and tiadinil in samples(a:Total ion Chromatograms of tiadinil;b:Total ion Chromatograms of fenhexamid)
表2 煙環(huán)酰菌胺和噻酰菌胺在水稻中的添加回收率和變異系數(shù)(n=5)Tab.2 Recovery rate and coefficients of variation of fenhexamid and tiadinil in rice(n=5)
本研究建立了采用乙腈提取,PSA和GCB凈化并結(jié)合UPLC-MS/MS快速同時檢測環(huán)酰菌胺和噻酰菌胺在稻田生態(tài)系統(tǒng)中的殘留量。此方法中環(huán)酰菌胺和噻酰菌胺在0.005~2 mg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關系,在0.005~2 mg/kg添加質(zhì)量分數(shù)范圍內(nèi)稻田土、稻田水、稻米、稻殼和水稻稈中的平均回收率為81.9%~107.6%,變異系數(shù)為1.4%~9.6%。該方法的準確度和靈敏度均符合我國國家標準的要求,且環(huán)保、簡便快捷,易操作,能夠滿足環(huán)酰菌胺和噻酰菌胺在稻田生態(tài)系統(tǒng)中殘留量的快速檢測和確證的要求。
[1]黃 偉,柴嬪姬,譚成俠.環(huán)酰菌胺合成工藝[J].農(nóng)藥,2012,51(8):562-564.
[2]趙衛(wèi)光,劉桂龍,王素華,等.新型稻田殺菌劑噻酰菌胺[J].農(nóng)藥,2003,42(10):47-48.
[3]ESTEVE-TURRILLASF A,ABAD-FUENTESA,MERCADER JV.Determination of fenhexamid residues in grape must,kiwifruit,and strawberry samples by enzyme-linked immunosorbent assay[J].Food chemistry,2011,124(4):1 727-1 733.
[4]LINA H,JEONG-HEUI C,JONG-HYOUK P,et al.Residual pattern of fenhexamid on pepper fruits grown under greenhouse conditions using HPLCand confirmation via tandem mass spectrometry[J].Food chemistry,2011,126(4):1 533-1 538.
[5]LIKASD T,TSIROPOULOSN G,MILIADISG E.Rapid gas chromatographic method for the determination of famoxadone,trifloxystrobin and fenhexamid residues in tomato,grape and wine samples[J].Journal of chromatography A,2007,1:208-214.
[6]賈福艷,劉志軍,劉永利,等.黃瓜與西葫蘆中環(huán)酰菌胺的殘留分析[J].農(nóng)藥,2012,51(8):590-591.
[7]郭慶龍,崔淑華,段 浩,等.高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定蔬果中啶酰菌胺和環(huán)酰菌胺殘留[J].食品科學,2012,33(10):255-259.
[8]王 嵐,徐 娟,謝建軍,等.高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜對動物源性食品中噻酰菌胺殘留的檢測[J].分析測試學報,2010,29(2):207-210.
[9]王 嵐,徐 娟,謝建軍,等.植物源性食品中噻酰菌胺殘留的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測[J].農(nóng)藥,2010(2):125-127.
[10]CHEN X Y,ZHAOK X,F(xiàn)AN ZJ,et al.Determination of Tiadinil and Its Metabolite in Flue-Cured Tobacco[J].Journal of chromatographic science,2013:90.
[11]陳武瑛,董豐收,劉新剛,等.分散固相萃?。咝б合嗌V-串聯(lián)質(zhì)譜法快速測定蘋果中代森錳鋅殘留[J].分析化學,2010,38(4):508–512.
[12]KING R,BONFIGLIO R,F(xiàn)ERNANDEZ-METZLER C,et al.Mechanistic Investigation of Ionization Suppression in Electrospray Ionization[J].J Am Soc Mass Spectrom,2000,11(11):942-950.
[13]LIU X G,XU J,LI Y B,et al.Rapid Residue Analysis of Four Triazolopyrimidine Herbicides in Soil,Water,and Wheat by Ultra-performance Liquid Chromatography Coupled to Tandem Mass Spectrometry[J].Analytical and Bioanalytical Chemistry,2011,399(7):2 539-2 547.