陳高瞻，蘆 蓮，雷 航，馬 峻，孫戰(zhàn)強(qiáng)，孫慶文，余曉麗，張舒林

(1.武漢輕工大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，湖北武漢 430023;2.復(fù)旦大學(xué) 遺傳工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200433;3.武漢市醫(yī)療救治中心檢驗(yàn)科，湖北武漢 430032;4.上海交通大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室，上海 200025)

結(jié)核病是一種古老的傳染性疾病，由結(jié)核分枝桿菌(MTB)感染引起的慢性傳染病。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)表明:每年有約130萬人死于結(jié)核病，其中98%的死亡病例發(fā)生在發(fā)展中國(guó)家;另外結(jié)核分枝桿菌感染者還呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，每年新增結(jié)核分枝桿菌感染者約860萬［1-2］。我國(guó)是世界上22個(gè)結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家之一，在發(fā)展中國(guó)家中結(jié)核患病者人數(shù)高居第二位。第五次全國(guó)結(jié)核病流行病學(xué)調(diào)查獲悉鏈霉素的耐藥性有著上升趨勢(shì)，我國(guó)結(jié)核分枝桿菌SM耐藥率僅次于異煙肼耐藥［3］。鏈霉素耐藥的主要原因之一是編碼16S rRNA的rrs基因發(fā)生突變。有報(bào)道顯示鏈霉素耐藥株基因突變與“北京基因型”MTB傳播密切相關(guān)［4］。筆者旨在探討武漢地區(qū)結(jié)核分枝桿菌鏈霉素耐藥基因rrs的突變特征，為進(jìn)一步探討rrs基因突變和結(jié)核分枝桿菌耐鏈霉素的相關(guān)性奠定基礎(chǔ)，為本地區(qū)耐藥株快速診斷提供數(shù)據(jù);同時(shí)研究武漢地區(qū)“北京基因型”菌株的流行趨勢(shì)以及rrs突變與“北京基因型”相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 菌種來源

84株臨床分離株菌株來源于武漢市醫(yī)療救治中心，采用結(jié)核菌藥敏試驗(yàn)方法(比例法)進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。收集病人痰液中的結(jié)核分枝桿菌陽性菌，經(jīng)菌種分離鑒定和藥敏試驗(yàn)獲取84株臨床分離株菌株。結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv(ATCC27294)來源于中國(guó)藥品生物制品檢驗(yàn)所。

1.2 主要試劑

實(shí)驗(yàn)所需瓊脂糖選用西班牙瓊脂糖Biowest Agarose，Gold View I型核酸染色劑(目錄號(hào):G8140-1)購(gòu)自于Solarbio公司。dNTP購(gòu)自上海生工，Taq酶購(gòu)自 Takara公司。DL2000 DNA Marker由CENEray Biotech公司提供。引物rrs-P1和rrs-P2由上海生工生物公司合成。

1.3 菌種分離、鑒定及藥敏實(shí)驗(yàn)

病人痰標(biāo)本中加入2倍體積4%NaOH，渦旋振蕩2 min后靜置15 min，加入PH 6.8的磷酸緩沖液5 mL混勻，3000×g離心15 min去上清液，向沉淀物加入磷酸緩沖液0.5 mL混勻后，接種于改良酸性羅氏固體(L-J)斜面培養(yǎng)基上分離培養(yǎng);將分離的抗酸桿菌進(jìn)行硝基苯甲酸(PNB)和噻吩二羧酸肼(TCH)生長(zhǎng)試驗(yàn)、28℃生長(zhǎng)試驗(yàn)、耐熱接觸酶試驗(yàn)等試驗(yàn)，進(jìn)一步鑒定篩選出所需的結(jié)核分枝桿菌群。采用絕對(duì)濃度法［5］檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌藥物敏感性和其耐藥濃度。

1.4 DNA模板制備

從改良酸性羅氏固體L-J斜面培養(yǎng)基上挑取結(jié)核分枝桿菌菌落加入500 μL 1×TE緩沖液中，于55℃下水浴3 h，95℃高溫滅活30 min，加等體積的酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)抽提3次，用高壓滅菌過的雙蒸水溶解于－20℃保存待用。

1.5 rrs基因PCR和電泳檢測(cè)

［6］，合成引物。rrs基因上游引物rrs-P1 序列:5＇-CATGCAAGTC-GAACGGAAAGG-3＇，下游引物 rrs-P2序列:5＇-CAGCGTCAGTTACTGCCCAGAG-3＇。PCR擴(kuò)增的DNA片段長(zhǎng)度為696 bp。PCR擴(kuò)增采用50 μL 的反應(yīng)體系(1.5 U Taq 酶，10—100 ng 模板 DNA，終濃度200 μmol/L dNTP，0.4 μmol/L rrs-P1 和 rrs-P2，1.5 mmol/L MgCl2)。PCR 程序:94℃預(yù)處理5 min;循環(huán)94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃30 s，共30個(gè)循環(huán);最后72℃延伸10 min。反應(yīng)完畢后于1%的瓊脂糖凝聚電泳檢測(cè)。

1.6 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序與分析

將rrs基因PCR擴(kuò)增的陽性產(chǎn)物用Omega-PCR產(chǎn)物回收試劑盒回收純化后測(cè)序，DNA序列測(cè)定交由上海生工武漢分部完成。測(cè)序結(jié)果在Genebank中與結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv比對(duì)。

1.7 北京基因型檢測(cè)

本研究中采用RD105缺失基因檢測(cè)法進(jìn)行“北京基因型”的鑒定。引物設(shè)計(jì)和反應(yīng)程序參照參考文獻(xiàn)［7］，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，擴(kuò)增出的750 bp左右的DNA片段即為“北京基因型”，擴(kuò)增出2條或多條帶的則為非“北京基因型”菌株。

2 結(jié)果與分析

2.1 rrs基因測(cè)序結(jié)果統(tǒng)計(jì)與鏈霉素耐藥水平

84株(包括44株耐鏈酶素菌株，20株耐其它藥物和20株全敏株)臨床分離菌株，均增出了696 bp的DNA片段(圖1)。據(jù)測(cè)序結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析顯示:44株鏈霉素耐藥菌株中有16(36.4%)株菌株的rrs基因發(fā)生突變(表1)。在這16株突變株中存在四種突變類型:9株1401位A→G突變(見圖2)(占總菌株10.7%，突變株 56.3%，MIC≥4-8 μg/mL)，6 株514位A→C突變(占總菌株7.1%，突變株37.5%，MIC≥2-8μg/mL)，1487位 G→A 點(diǎn)突變(MIC=8μg/mL)各1株。20株對(duì)鏈霉素敏感但耐其它藥物的菌株中，1株1401位A→G突變，1株514位A→C突變。20株全敏株中，1株1029位點(diǎn)C→T點(diǎn)突變。

圖1 rrs基因PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)情況

圖2 臨床分離菌株WH40菌株rrs基因1401位點(diǎn)突變情況

表1 耐鏈霉素臨床分離株的rrs突變結(jié)果及北京基因型統(tǒng)計(jì)(n=44)

2.2 北京基因型檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)

本研究中84株菌株經(jīng)RD105缺失基因檢測(cè)，所有“北京基因型”菌株均擴(kuò)增出單一條帶，非“北京基因型”均擴(kuò)增出了非特異性條帶。有77株P(guān)CR擴(kuò)增出了750 bpDNA片段鑒定為“北京基因型”菌株，占全部菌株的91.7%;非“北京基因型”有7株，其中有2株為全敏菌株(表2)?！氨本┗蛐汀辫b定結(jié)果顯示:在武漢地區(qū)流行的結(jié)核分枝桿菌主要為“北京基因型”。在44株鏈霉素耐藥菌株中，“北京基因型”占40株(90.9%)，且16株突變菌株15株為“北京基因型”(表1)。其中鏈霉素耐藥菌株中，“北京基因型”菌株突變比為93.8%(15/16)高于非“北京基因型”菌株25%(1/4)。44株鏈霉素耐藥MTB中，主要突變類型為A514C和A1401G，二者與“北京基因型”沒有顯著地相關(guān)性(P=1.00 ＞0.05;P=0.94 ＞0.05)。

表2 結(jié)核分枝桿菌臨床分離菌株耐藥表型及北京基因型鑒定結(jié)果(n=84)

3 討論

鏈霉素是最早用于結(jié)核病治療的抗生素，是一類氨基糖苷類抗生素。作為治療結(jié)核病的四種一線藥物之一，鏈霉素主要作用于核糖體30S小亞基(由21種核糖體蛋白和16S rRNA組成)，誘導(dǎo)遺傳密碼的錯(cuò)誤，抑制mRNA的轉(zhuǎn)錄過程，通過干擾菌體蛋白質(zhì)合成來發(fā)揮抗菌作用［8］。結(jié)核分枝桿菌耐鏈霉素突變菌株是由于其核糖體靶位突變，其中編碼16S rRNA的rrs基因是鏈霉素耐藥菌株的主要突變基因之一［9］。

本次研究中的44株耐鏈霉素菌株的rrs基因突變率高達(dá)36.4%(16/44)，比吳雪瓊等人報(bào)導(dǎo)［10］的結(jié)果高，主要由于環(huán)境問題日趨嚴(yán)峻，其次也不排除地域差異和實(shí)驗(yàn)樣本量有限等因素。本次研究中，作為鏈霉素耐藥菌株主要突變基因之一的rrs基因其突變位點(diǎn)主要發(fā)生在514和1401位點(diǎn)，且大都伴隨鏈霉素高水平耐藥，但是分別有兩個(gè)514和1401位點(diǎn)突變的菌株發(fā)現(xiàn)其鏈霉素的MIC值小于0.25 μg/mL，這降低了 514 和 1401 位點(diǎn)突變用于鏈霉素耐藥檢測(cè)的特異性，相似的情況國(guó)內(nèi)也有報(bào)道［11-12］，另外有25株鏈霉素耐藥菌株未發(fā)生突變，但也有部分出現(xiàn)鏈霉素高耐，這可能由于結(jié)核分枝桿菌SM耐藥性還存在其他耐藥機(jī)制［13］。

本次研究中，“北京基因型”鑒定結(jié)果顯示:84株臨床分離菌株中有77株菌株為“北京基因型”，占所有菌株的91.7%為武漢地區(qū)廣泛流行的結(jié)核分枝桿菌，非“北京基因型”7株，和相關(guān)報(bào)道［14］的“北京基因型”的結(jié)核分枝桿菌具有更強(qiáng)的遺傳與傳播能力的結(jié)果相吻合。其中44株耐藥菌株中16株突變菌株有15株為“北京基因型”，說明北京基因型的結(jié)合分枝桿菌更容易突變，這也進(jìn)一步闡明了在當(dāng)前快速鑒定“北京基因型”結(jié)核分枝桿菌的重要性［15-17］。

來自天津、新加坡等地區(qū)的報(bào)道［4，18］提示鏈霉素耐藥結(jié)核分枝桿菌的傳播可能與“北京基因型”有關(guān)。新加坡的報(bào)道顯示rpsL基因K43R突變與鏈霉素耐藥結(jié)核分枝桿菌的“北京基因型”和非“北京基因型”有顯著差異，而王擷秀等人的結(jié)果卻是相反的。本研究中，rrs的主要突變的514和1401位點(diǎn)突變與“北京基因型”沒有顯著地相關(guān)性。證明了不同地區(qū)的北京基因型鏈霉素耐藥株的傳播機(jī)制不盡相同。

綜上所述，結(jié)核分枝桿菌rrs基因突變和鏈霉素高水平耐藥性相關(guān)，突變類型以A514C，A1401G為主，突變頻率偏高，故通過rrs基因可以作為檢測(cè)中部地區(qū)結(jié)核分枝桿菌耐鏈霉素菌株的靶基因。結(jié)核分枝桿菌“北京基因型”菌株的傳播類型和鑒定應(yīng)當(dāng)引起相關(guān)部門重視。rrs基因突變和“北京基因型”相關(guān)性分析為了解“北京基因型”菌株潛在的傳播機(jī)制提供了重要的參考。

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