蘆 蓮，陳高瞻，黃小琴，雷 航，胡申才，李 睿，劉志國，余曉麗

(1.武漢輕工大學 生物與制藥工程學院，湖北武漢 430023;2.武漢輕工大學校醫(yī)院，湖北武漢 430023)

結(jié)核病是嚴重威脅人類健康的傳染性疾病，伴隨著整個人類發(fā)展史。據(jù)WHO統(tǒng)計，2011年全球約有870多萬結(jié)核病病人，我國是全球22個結(jié)核病高發(fā)率國家之一，同時也是全球27個耐多藥(MDR)結(jié)核病流行嚴重的國家之一［1］。鏈霉素(streptomycin，SM)作為最早應(yīng)用于臨床的氨基糖苷類抗生素，一直是最主要的一線抗結(jié)核藥之一［2］，研究表明，核糖體30S亞基S12的編碼基因rpsL突變是MTB對鏈霉素耐藥的主要機制，16S rRNA編碼基因rrs突變介導其對鏈霉素的耐藥性［3］，且rpsL主要突變位點的突變率及突變類型有明顯的地域差異［4］。筆者旨在探討武漢地區(qū)結(jié)核分枝桿菌SM耐藥臨床分離株rpsL基因分子特征，為進一步研究結(jié)核分枝桿菌SM耐藥機制和臨床SM用藥提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 菌株來源及藥物敏感性實驗

結(jié)核分枝桿菌標準菌株H37Rv(ATCC27294)購自中國藥品生物制品鑒定所，71株臨床分離株來源于武漢醫(yī)療救治中心2009年8月至2010年7月被診斷為結(jié)核病的患者，參照結(jié)核病診斷實驗室檢驗規(guī)程［5］，采用比例法進行藥敏試驗(4 mg/L)，其中SM敏感株20株，SM耐藥株51株(表1)。

1.2 MIC(最小抑菌濃度)測定

MIC采用刃天青法測定［6］。在96孔培養(yǎng)板中，用Middlebrook 7H9(BD公司)液體培養(yǎng)基將SM進行連續(xù)雙倍稀釋，倍比稀釋終濃度依次為16—0.25 mg/L。每個梯度設(shè)3個重復，加入適量的菌液和刃天青(sigma公司)，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔2 h觀察一次顏色變化，MIC值為肉眼可見的顏色改變時的藥物濃度。

1.3 DNA 制備

采用經(jīng)典的酚/氯仿提取法［7］提取 DNA于－20℃保存。

1.4 rpsL基因PCR擴增

根據(jù)結(jié)核分枝桿菌H37Rv標準株rpsL(Gene ID:888259)基因，用Primer 5.0和 Oligo 6軟件設(shè)計引物，引物對由上海生工生物工程股份有限公司合成。rpsL引物序列:5＇-GTAGATGCCAACCATCCAGC-3＇( 上游)，5＇-CATCAGCCCTTCTCCTTCTTA-3＇(下游);擴增381bp的核酸片段。采用50 μL反應(yīng)體系，其中包括10 × PCR 緩沖液5 μL，2.5 mmol/L 四種 dNTP 各1 μL，上下游引物各1 μL，DNA 模板 5 μL，Taq 聚合酶0.4 μL，三蒸水 35 μL。PCR 反應(yīng)程序:94℃ 5 min;94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，35個循環(huán);最后72℃ 5 min。待PCR擴增完成后，將PCR產(chǎn)物加樣至1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.5 測序與分析

PCR擴增陽性產(chǎn)物經(jīng)GoldMag-PCR產(chǎn)物純化試劑盒回收和純化后，送至上海生工武漢分公司測序，測序結(jié)果與Genbank中結(jié)核分枝桿菌標準菌株H37Rv進行比對。

1.6 北京基因型鑒定

采用RD105基因缺失法［8］鑒別“北京基因型”菌株，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，PCR反應(yīng)陽性鑒定為“北京基因型”。

2 結(jié)果

2.1 rpsL基因測序結(jié)果

20株對SM敏感的臨床分離株均未檢測到rpsL突變，51株SM耐藥株中有35株(68.6%)檢測到rpsL突變，16株未檢測到rpsL突變。35株檢測到的rpsL突變主要發(fā)生在第43位和第88位密碼子，其中30株(58.8%)為Lys 43 Arg AAG→AGG的突變，5株(9.8%)為rpsL 88位突變，rpsL 88位突變包括兩種類型:Lys 88 Arg AAG → AGG(7.8%，4/51)和Lys88GluAAG → GAG(2.0%，1/51)(表 1，圖1)。

2.2 MICs值分析

71株臨床分離株的SM MICs值、rpsL突變結(jié)果及北京基因型分布情況見表1。20株SM敏感株rpsL基因未突變，MICs＜0.25 mg/L，51株 SM 耐藥株MIC≧1 mg/L，以8 mg/L為主(15株)，最高MIC為＞16 mg/L。

2.3 北京基因型鑒定結(jié)果

71株臨床分離株中有65株(91.5%)“北京基因型”菌株;6株“非北京基因型”菌株(表1)。這表明在武漢地區(qū)流行的結(jié)核分枝桿菌主要為“北京基因型”。而在 51株 SM耐藥菌株中，有 47株(92.2%)為“北京基因型”菌株，35株 rpsL突變菌株中，有33株(94.3%)為“北京基因型”菌株，這可能跟“北京基因型”菌株較其他菌株有更強的致病性、傳播力以及更易發(fā)生基因突變?yōu)槟退幘暧嘘P(guān)［9］。

圖1 耐SM臨床分離株rpsL基因點突變Lys43Arg AAG→AGG

表1 臨床分離株rpsL基因突變情況 (n=71)

2.4 rpsL基因突變與SM耐藥水平之間的關(guān)系

30株rpsL 43突變株MICs大部分(27株)分布在2 mg/L到 ＞16 mg/L，另有兩株 MIC為 0.5 mg/L，一株 MIC為 1 mg/L。5株 rpsL88突變株MICs均大于2 mg/L。SM MIC≦1 mg/L的菌株(低水平耐藥株)rpsL突變率為50%(3/6)，SM MIC≧2 mg/L的菌株(高水平耐藥株)的rpsL 43位和88位總突變率為71.1%(32/45)。

3 討論

SM首先與結(jié)構(gòu)正常的細菌核糖體蛋白S12結(jié)合，在其介導下，結(jié)合細菌核糖體30S亞基上的16S rRNA，干擾氨酰tRNA與30S rRNA的連接，來阻斷細菌蛋白質(zhì)的合成，從而發(fā)揮藥效［10］。研究表明rpsL突變可能與SM高耐藥有關(guān)［11］，且多發(fā)生于北京基因型菌株［12］。

研究報道，新加坡地區(qū)rpsL基因突變率為44.4%［12］;東印度地區(qū) rpsL 基因突變率為 40%［13］;本研究中，rpsL基因突變率為68.6%，明顯高于上述地區(qū);與深圳(68.3%)［3］和杭州地區(qū)(77.5%)［14］相近，比浙江 (33.3%)高［15］。本研究中 rpsL基因突變類型主要有Lys43Arg(AAG→AGG)、Lys88Arg AAG→AGG，還有一株 Lys88Glu AAG→GAG，與其他地區(qū)(新加坡、東印度、深圳、杭州、浙江麗水)有所不同［3，12-14］。綜上所述，SM 耐藥菌株rpsL基因突變率及突變類型均存在地域差異。

本研究中SM敏感株的rpsL基因未突變MICs＜0.25 mg/L，SM低水平耐藥株總突變率(50%(3/6))低于高水平耐藥株(71.1%(32/45))，rpsL突變與SM高水平耐藥的相關(guān)性在本研究中關(guān)聯(lián)度不大(χ2=0.335，P=0.563)，與相關(guān)報道有差異［11］，可能與本研究中耐藥株數(shù)量有限有關(guān)，應(yīng)加大樣本含量進一步驗證。

本研究中SM耐藥株中92.2%(47/51)為“北京基因型”菌株，SM敏感株中90%(18/20)為“北京基因型”菌株，但北京基因型與耐藥株關(guān)聯(lián)度不大(χ2=0.000，P=1.000)，可能與本研究的樣本量大小有關(guān)，需要更多實驗驗證。在武漢地區(qū)流行的結(jié)核分枝桿菌主要為“北京基因型”，與“北京基因型”傳播力強的相關(guān)報道一致［16］，應(yīng)該加強武漢地區(qū)結(jié)核預防。

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