李云攀，劉美云，趙雯娜，陳作元

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）所致的心、腦血管疾病嚴重危害人類生命健康?，F(xiàn)普遍認為，AS的形成是各種損傷因素作用于血管內(nèi)皮細胞，導致內(nèi)皮細胞功能障礙，并進一步表達和釋放各種活性物質及黏附分子共同參與的慢性炎癥過程[1-3]。同時，多種活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）所誘發(fā)的氧化應激反應在冠狀動脈粥樣硬化性心臟病病理生理過程中發(fā)揮重要作用[4]。本實驗觀察大鼠動脈粥樣硬化相關血清炎癥指標血管內(nèi)皮細胞鈣黏蛋白（VE-cadherin）、脂聯(lián)素（APN）與氧化應激指標8-異前列腺素-F2a（8-iso-PGF2a）、超氧化物歧化酶（SOD）表達水平及主動脈壁病理組織學改變，并觀察單獨和聯(lián)合應用降血脂藥（瑞舒伐他?。┖涂寡趸瘎ㄆ樟_布考）對以上指標的影響，為臨床合理用藥提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1實驗材料

1.1.1動物健康清潔級雄性Wistar大鼠54只（山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司質檢中心提供），8周齡，體重180～220 g，飼養(yǎng)房分籠喂養(yǎng)（4～6只/籠），自由飲食。

1.1.2高脂飼料配制[5]69%基礎飼料、20%豬大油、5%白糖、3%膽固醇、0.5%膽酸鈉、0.2%丙基硫氧嘧啶、1%葡萄糖酸鈣，2%蛋黃粉。

1.1.3試驗藥品與試劑瑞舒伐他汀鈣片（10 mg/片，阿斯利康制藥有限公司，批號：115449）；普羅布考（0.125 g/片，齊魯制藥有限公司，批號：2030031KL）；注射用卵清白蛋白（美國Sigma公司）；大鼠VE-vadherin酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒、大鼠ADP酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒、大鼠8-iso-PGF2a ELISA試劑盒、大鼠SOD ELISA試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2方法

1.2.1動物分組54只大鼠適應性喂養(yǎng)1周，1周后隨機分5組，正常組（A組）12只，模型組（B組）12只，瑞舒伐他汀組（C組）10只，普羅布考組（D組）10只，瑞舒伐他汀+普羅布考組（E組）10只。

1.2.2動物模型建立A組普通飼料喂養(yǎng)，B組及藥物干預組高脂飼料喂養(yǎng)同時給予卵清白蛋白2.5 mg/kg腹腔注射（5次/周）[6]。第8周末，A、B兩組各隨機選取2只大鼠，麻醉后處死，取主動脈弓處血管1 cm，固定，石蠟包埋，后進行HE染色，光鏡下觀察血管壁病理組織學改變，確定大鼠AS模型建立情況。第9周起，模型組及藥物干預組高脂飼料喂養(yǎng)同時每日進行藥物干預，C組給予瑞舒伐他汀5 mg/kg.d灌胃，D組給予普羅布考500 mg/kg.d灌胃，E組給予瑞舒伐他汀5 mg/kg.d+普羅布考500mg/kg.d灌胃，A、B組給予生理鹽水灌胃作為對照，連續(xù)干預8周。

1.2.3血清學指標檢測第16周末，全部大鼠禁食12 h, 10%水合氯醛4 ml/kg腹腔注射麻醉。開胸經(jīng)右心房取血3 ml，置于普通生化管中，以3000 r/min離心，取上層血清，置于-70℃保存。采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）經(jīng)標準品的稀釋、加樣、孵育、洗滌、加酶顯色、測定OD值等過程，通過標準曲線計算血清VE-cadherin、8-iso-PGF2a、APN、SOD的表達。

1.2.4 HE染色第16周末，留取血清后，取主動脈弓處血管1 cm，放于4%多聚甲醛溶液中固定24小時。將固定好的血管組織經(jīng)梯度酒精脫水、二甲苯溶液組織透明、石蠟包埋后，切片。二甲苯脫蠟，再經(jīng)由高濃度到低濃度酒精，蒸餾水沖洗，蘇木精染色、伊紅染色，脫水透明、固定。光鏡下觀察主動脈壁內(nèi)膜光滑度和厚度、內(nèi)膜細胞排列情況、內(nèi)膜下有無脂肪細胞和泡沫細胞聚集等，隨機選取5個視野，應用Simple PCI圖像分析軟件測量主動脈內(nèi)膜厚度，取平均值。

1.3統(tǒng)計學分析采用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計處理，計量資料采用（s）表示，多樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1動物模型建立第8周末，A、B兩組大鼠，光鏡下觀察其主動脈血管壁病理組織學改變。A組血管內(nèi)膜光滑完整且較薄，細胞排列整齊（圖1A）；B組血管內(nèi)膜明顯增厚，內(nèi)皮細胞排列紊亂，可見多發(fā)的不規(guī)則脂質條紋，有脂肪細胞和泡沫細胞聚集（圖1B），表明動脈粥樣硬化模型建立成功。

2.2各組大鼠血清相關指標變化與A組比較，模型組和藥物干預組血清VE-cadherin、8-iso-PGF2a水平顯著升高（P＜0.01）；APN、SOD水平降低（P＜0.01）； 與B組比較，C、D、E組血清VE-cadherin、8-iso-PGF2a水平降低（P＜0.01），APN、SOD表達明顯升高（P＜0.05）；與C組比較，D、E組血清8-iso-PGF2a水平下降（P＜0.01），SOD水平升高（P＜0.01）；與C、D組比較，E組血清VE-cadherin降低（P＜0.01），APN升高（P＜0.05，表 1）。

圖1 第8周末A、B兩組大鼠主動脈HE染色 [（200×），A：正常組；B：模型組]

2.3各組大鼠主動脈病理組織學改變第16周末，光鏡下觀察大鼠主動脈病理變化，A組血管內(nèi)膜光滑（圖2A），細胞排列規(guī)則。與A組比較，B組血管內(nèi)膜明顯增厚（P＜0.01，圖2B），細胞排列紊亂，可見泡沫細胞和單核細胞，且細胞間隙增寬；與B組比較，C、D、E組血管壁內(nèi)膜厚度變?。≒＜0.01）（圖2C、D、E）。與C、D組比較，E組血管內(nèi)膜變薄（P＜0.05，表1）。

3 討論

圖2 16周末各組大鼠主動脈HE染色[（400×）；A：正常組；B：模型組；C：瑞舒伐他汀組；D：普羅布考組；E：瑞舒伐他汀+普羅布考組

越來越多的研究表明，炎性反應在AS的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，其主要由巨噬細胞黏附于血管內(nèi)膜，于脂質沉積在血管內(nèi)膜時，單核巨噬細胞可與血管內(nèi)皮細胞表面受體結合吞噬脂蛋白，并轉化為泡沫細胞，釋放多種炎性細胞因子，加重組織損傷[7]。

氧化應激是體內(nèi)參與氧化和抗氧化作用相關物質的比例失衡，從而機體產(chǎn)生過多的氧自由基，引起細胞的毒性反應[8,9]。氧化應激損傷也參與了AS發(fā)病的整個過程，可通過活性氧的氧化作用誘導血管內(nèi)膜細胞相關基因的表達，促進局部炎性反應和細胞增殖。炎性反應和氧化應激共同作用可加重對血管內(nèi)膜的損傷，加快AS的發(fā)病進程。

VE-cadherin，又名CD144，屬于鈣粘蛋白家族成員之一，廣泛表達于血管內(nèi)皮細胞的膜表面，在血管結構及功能的完整性、血管內(nèi)皮間的通透性以及炎性細胞在血管內(nèi)皮的表達等方面起重要作用[10]。VE-cadherin在動脈硬化新生血管形成及斑塊不穩(wěn)定過程中扮演了重要的角色，其過度表達能夠提示AS的進展，本研究通過檢測內(nèi)皮功能指標VE-cadherin的含量，可間接提供有關早期AS的信息[11]。近期研究[12]結果顯示，與正常組比較，AS模型組小鼠血清VE-cadherin的表達與炎癥因子腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）的表達水平呈正相關，提示血清VE-cadherin水平可以反映血管內(nèi)皮細胞損害程度。因此VE-cadherin成為研究AS的重要指標。APN是近幾年新發(fā)現(xiàn)的脂肪組織特異性蛋白，研究發(fā)現(xiàn)APN在AS的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮抵抗作用。APN可在內(nèi)皮細胞表面通過激活AMPK信號通路，促進內(nèi)源性一氧化氮的產(chǎn)生與釋放，抑制血管內(nèi)膜的炎癥反應，發(fā)揮保護作用。APN是目前被證實與代謝綜合征、糖尿病及心血管疾病呈負相關的脂肪因子，作為AS的保護性因子，可作用于AS發(fā)病機制的多個環(huán)節(jié)，也可抑制炎癥因子的表達，具有抗炎及抗AS的作用[13,14]，成為近幾年的研究熱點。8-iso-PGF2a是氧自由基損傷細胞膜多不飽和脂肪酸，如花生四烯酸（arachidonic acid，AA）等，使其發(fā)生脂質過氧化而形成的終末產(chǎn)物，在體液和組織中的含量極其穩(wěn)定，能夠準確、穩(wěn)定地反映體內(nèi)脂質氧化應激的程度，常將其作為評價體內(nèi)氧化應激水平的最佳標準[15]。SOD是體內(nèi)天然存在的抗氧化因子，可抑制氧化應激因素對血管內(nèi)膜的損傷作用，抑制和逆轉AS斑塊進展，并可修復損傷的血管內(nèi)膜[16]。

表1 各組大鼠血清炎癥應激指標及主動脈內(nèi)膜厚度比較（s）

表1 各組大鼠血清炎癥應激指標及主動脈內(nèi)膜厚度比較（s）

注：VE-cadherin：血管內(nèi)皮細胞鈣黏蛋白；8-iso-PGF2a：8-異前列腺素-F2a；APN：脂聯(lián)素；SOD：超氧化物歧化酶；與A組比較，aP＜0.01；與B組比較，bP＜0.01；與C組比較，cP＜0.01；與D組比較，dP＜0.05

組別 VE-cadherin（mg/L）8-iso-PGF2a（ng/L）APN（ng/ml）SOD（u/L）主動脈內(nèi)膜厚度（μm）A組（n=10）2.41±0.34 66.44±10.82 113.15±7.32 148.12±9.69 9.86±2.11 B組（n=10）5.90±1.20a 114.72±11.60a 74.12±7.74a 95.93±11.62a 33.64±6.06a C組（n=10）3.45±0.54ab 91.62±7.01ab 90.05±6.94ab 111.80±14.08ab 22.67±5.50ab D組（n=10）3.30±0.41ab 79.19±9.03abc 94.99±8.50ab 134.28±6.61abc 21.51±3.76ab E組（n=10）2.58±0.54abcd 79.66±6.65abc 104.55±4.46abcd 133.23±10.33abc 17.20±2.69abcd

在本研究中，大鼠AS VE-cadherin、8-iso-PGF2a水平明顯升高，APN、SOD水平明顯降低，表明炎癥和氧化應激作用可能參與AS早期病變發(fā)展。實驗中期分別給予瑞舒伐他汀、普羅布考及兩藥聯(lián)合干預后，VE-cadherin、8-iso-PGF2a水平顯著降低，APN、SOD水平顯著升高，兩藥合用可明顯降低血清VE-cadherin、8-iso-PGF2a的表達，并提高APN、SOD的表達。同時光鏡下觀察，兩藥合用主動脈內(nèi)膜損傷較單獨用藥減輕，且內(nèi)膜厚度較單用藥組薄。本研究結果表明，瑞舒伐他汀可能通過降低血清VE-cadherin含量，并升高APN的表達，來發(fā)揮其抗炎作用，達到穩(wěn)定AS斑塊、修復受損血管內(nèi)膜的作用。而普羅布考則可能通過降低血清8-iso-PGF2a含量，并升高SOD表達，來發(fā)揮其抗氧化作用。

綜上所述，瑞舒伐他汀與普羅布考均具有抗炎和抗氧化作用，普羅布考的抗氧化作用優(yōu)于瑞舒伐他汀，兩藥合用可明顯降低血清VE-cadherin水平，并升高ANP的表達。本實驗結果可指導兩藥在臨床中更合理的應用。

[1]Zernecke A,Weber C. Chemokines in the vascular inflammatory response of atherosclerosis[J]. Cardiovascular Research,2010,86(2):1 92-101.

[2]蘇珂,龍艷,黃漓莉,等. 2型糖尿病高尿酸患者動脈粥樣硬化與白細胞介素10和脂聯(lián)素的關系[J]. 中國動脈硬化雜志,2013,21(4):331-5.

[3]談春芝,吳潔,唐朝克,等. 白細胞介素4與動脈粥樣硬化[J]. 中國動脈硬化雜志,2011,19(2):155-9.

[4]Seo H,Oh H,Park H,et al. Contribution of dietary intakes of antioxidants to homocysteine-induced low density lipoprotein(LDL)oxidation inatherosclerotic patients[J]. Yonsei Med J,2010,51(4):526-33.

[5]王園園,龍民慧,鄒民吉,等. 大鼠動脈粥樣硬化動物模型的建立和評價[J]. 中國實驗動物學報,2008,16(6):421-3.

[6]Campbell LA,Blessing E,Rosenfeld M,et al. Mouse models of copneumoniae infection and atherosclerosis[J]. J Infect Dis,2000,181(3):508-13.

[7]Lobatto ME,Calcagno C,Metselaar JM,et al. Imaging the efficacy of anti-inflammatory liposomes in a rabbit model of atherosclerosis by non-invasive imaging [J]. Methods Enzymol,2012,508:211-28.

[8]Fujimoto H,Kobayashi H,Ohno M. Age-induced reduction in mitochondrial manganese superoxide dismutase activity and tolerance of macrophages against apoptosis induced by oxidized low density lipoprotein[J]. Circulation,2010,74(2):353-60.

[9]林春喜,林建聰,郭潤民,等. 硫化氫通過調(diào)控JNK通路對抗高糖誘導的心肌細胞氧化應激損傷[J]. 中國動脈硬化雜志,2013,21(1):1-5.

[10]Verin AD. Tyrosine phosphorylation and endothelial cell barrier regulation[J]. Am J Pathol, 2005,166(4):955-7.

[11]程王生,張鉦,白鋒,等. 冠心病患者中血管內(nèi)皮細胞鈣黏蛋白的檢測及臨床意義[J]. 中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志,2006,16(16):851-7.

[12]尹海鵬,劉向群,等. 黃芩苷對ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化及VE-鈣黏蛋白表達水平的影響[J]. 山東大學學報(醫(yī)學版),2013,51(9):26-30.

[13]Antoniades C,Antonopoulos AS,Tousoulis D,et al. Adiponectin:from obesity to cardiovascular disease[J]. Obes Rev,2009,10(3):269-79.

[14]Persson J,Folkersen L,Ekstrand J,et al. High plasma adiponectin concentration is associated with all-cause mortality in patients with carotid atherosclerosis[J]. Atherosclerosis,2012, 225(2):491-6.

[15]Morrow JD. Quantification of isoprostanes as indices of oxidant stress and the risk of atherosclerosis in humans[J]. Arterioscler Thromb Vase Biol,2005,25(2):279-86.

[16]Teodoro BG,Natali AJ,Fernandes SAT,et al. Improvements of atherosclerosis and hepatic oxidative stress are independent of exercise intensity in LDLr-/-mice[J]. J Atheroscler Thromb,2012,19(10):904-11.