翁琳+楊俊發(fā)+柴曉宇+許飛

[摘要] 目的 開發(fā)一種可以快速、準(zhǔn)確檢測(cè)肺炎衣原體的檢測(cè)方法。 方法 采用環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)（LAMP）對(duì)肺炎衣原體的特異性DNA保守片段進(jìn)行擴(kuò)增，將擴(kuò)增的DNA與基因芯片進(jìn)行雜交，觀察是否可在芯片相應(yīng)的區(qū)域出現(xiàn)雜交信號(hào)。 結(jié)果 只有肺炎衣原體DNA經(jīng)LAMP反應(yīng)后出現(xiàn)特異性的擴(kuò)增條帶，經(jīng)LAMP擴(kuò)增后的產(chǎn)物與基因芯片雜交，僅肺炎衣原體區(qū)域出現(xiàn)雜交信號(hào)。 結(jié)論 LAMP技術(shù)聯(lián)合基因芯片技術(shù)具有高度敏感性、高度特異性的特點(diǎn)，可快速準(zhǔn)確地檢測(cè)肺炎衣原體。

[關(guān)鍵詞] 環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)；基因芯片；肺炎衣原體；雜交

[中圖分類號(hào)] R563.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2014）09（c）-0004-03

Application of LAMP combined with gene chip technology in detection of Chlamydia pneumoniae

WENG Lin1 YANG Jun-fa2 CHAI Xiao-yu2 XU Fei3▲

1.The Second People′s Hospital of Yichun City in Jiangxi Province，Yichun 336000，China；2.Medical College of Nanchang University，Nanchang 336000，China；3.Department of Respiratory Medicine，the First Affiliated Hospital of Nanchang University，Nanchang 336000，China

[Abstract] Objective To invent a rapid and accurate method to detect Chlamydia pneumonia（CP）. Methods The specific DNA conservative segment of CP was amplified by using loop-mediated isothermal amplification（LAMP）.The amplified DNA and gene chip were hybridized.Whether the hybridization signal appearing or not in the corresponding region of the chip was observed. Results Only the amplified CP-DNA by LAMP appeared the specific amplification bands.After the LAMP sequence was hybridized with gene chip，only in the CP area appeared corresponding hybridization signal. Conclusion LAMP combined with gene chip technology have characteristics of high sensitivity，high specificity，can detect CP quickly and accurately.

[Key words] Loop-mediated isothermal amplification；Gene chip；Chlamydia pneumoniae；Hybridization

肺炎衣原體（Chlamydia pneumoniae，CP）是社區(qū)獲得性肺炎（community-acquired pneumonia，CAP）的一種致病菌，年老體弱、免疫力低下者容易感染，且易反復(fù)，不易控制。隨著我國(guó)老齡化的日益嚴(yán)重，CP所致肺炎的發(fā)病率及死亡率有上升趨勢(shì)。早期明確診斷病原菌非常重要，但現(xiàn)階段臨床上對(duì)于CP的檢測(cè)還相對(duì)滯后，本研究旨在開發(fā)一種可以快速、準(zhǔn)確檢測(cè)CP的方法。環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是一種新的核酸擴(kuò)增方法，具有簡(jiǎn)便、快速、高特異性好等優(yōu)點(diǎn)[1-4]?；蛐酒s交技術(shù)能在面積較小的載體上同時(shí)檢測(cè)多種病原菌，具有快速、準(zhǔn)確、高通量等優(yōu)點(diǎn)[5-6]。本研究采用LAMP技術(shù)對(duì)CP的靶基因進(jìn)行擴(kuò)增，后將擴(kuò)展產(chǎn)物與基因芯片雜交，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)CP的特異性檢測(cè)。

1 資料與方法

1.1 菌種標(biāo)準(zhǔn)DNA來(lái)源

CP-DNA由南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科研究室自行制備及保存，而金黃色葡萄球菌、志賀菌、普通變形桿菌、大腸埃希菌、霍亂弧菌、枯草桿菌、沙門菌DNA均購(gòu)買于北京美萊博醫(yī)學(xué)科技有限公司。

1.2 主要試劑、儀器

試劑：2×PCR TaqMix（Tiangen Biotech）、BstDNA聚合酶（New England Biolabs公司）、引物（上海生工生物有限公司）、抽提液、雜交緩沖液、顯色液、DNA Marker 500 bp。儀器：PCR儀（Biometra）、點(diǎn)樣儀（Omni Grid100）、電泳儀（Bio Rad公司）、紫外成像系統(tǒng)（Alphalmager EC）、共聚焦激光掃描儀（Gene Pix 4000B）。

1.3 引物及探針的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank公布的CP特異性基因片段——ompA基因，并依據(jù)此基因片段設(shè)計(jì)合理的引物和探針。引物及探針均購(gòu)于上海生工生物工程有限公司，CP的特異引物序列見表1。

表1 CP的LAMP特異性引物序列

1.4 芯片制備

基因芯片由上海芯片國(guó)家工程研究中心點(diǎn)制（圖1），其檢測(cè)原理是利用上述合成的探針與熒光標(biāo)記的靶基因雜交，然后根據(jù)雜交信號(hào)強(qiáng)弱評(píng)判結(jié)果的一種定性檢測(cè)。先將上述合成的探針稀釋調(diào)整濃度至30 μmol/L，使用醛基化玻片進(jìn)行點(diǎn)樣，將每個(gè)樣品點(diǎn)成4×4的矩陣，每個(gè)芯片上可以容納32個(gè)矩陣，點(diǎn)制好的芯片置于干燥箱中保存?zhèn)溆谩ｊ?yáng)性對(duì)照選用Poly（T）-Biotin，探針稀釋液為空白對(duì)照組，無(wú)同源性的酵母基因?yàn)殛幮詫?duì)照。

圖1 探針點(diǎn)樣示意圖

M.肺炎支原體；C.CP；L.嗜肺軍團(tuán)菌；P.陽(yáng)性對(duì)照；N.陰性對(duì)照；B.空白對(duì)照

1.5 LAMP擴(kuò)增及反應(yīng)產(chǎn)物的檢測(cè)

先將F3 4 μl、B3 4 μl、FIP 16 μl、BIP 16 μl、ddH2O 50 μl混合均勻配制CP引物，在各PCR管中加入CP引物（1 μl）、模板DNA（2 μl）、ddH2O（6.2 μl）、Bst酶（0.8 μl）混和均勻后置于PCR儀中，溫度設(shè)置為80℃，時(shí)間為10 min。將LAMP反應(yīng)產(chǎn)物置于離心機(jī)中以12 000 r/min速度離心1 min，后將沉淀產(chǎn)物放入1.5%瓊脂糖凝膠中電泳25 min，于凝膠成像系統(tǒng)中成像。

1.6 芯片雜交

取每個(gè)LAMP反應(yīng)產(chǎn)物10 μl與200 μl雜交緩沖液混合10 min（溫度設(shè)置為98℃），立即轉(zhuǎn)移至0℃環(huán)境5 min，最后轉(zhuǎn)移至芯片反應(yīng)區(qū)內(nèi)，平鋪均勻，設(shè)置溫度為45℃，雜交3 h后進(jìn)行芯片掃描，根據(jù)熒光信號(hào)強(qiáng)度的分析結(jié)果。

1.7 敏感性檢測(cè)

取一定量CP-DNA并測(cè)定其濃度，先將DNA濃度調(diào)整到22.5 ng/μl，后行10倍梯度稀釋（范圍為10-1～10-10），各取1 μl CP-DNA進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，使用電泳法檢測(cè)各濃度的擴(kuò)增倍數(shù)。

1.8 特異性檢測(cè)

先對(duì)本研究檢測(cè)的CP-DNA和其他菌種DNA進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，通過(guò)電泳法檢測(cè)各反應(yīng)產(chǎn)物的差異。后將各反應(yīng)產(chǎn)物行基因芯片雜交，根據(jù)雜交信號(hào)的不同判斷其特異性。

2 結(jié)果

2.1 LAMP檢測(cè)CP特異性結(jié)果

僅CP-DNA經(jīng)LAMP反應(yīng)后出現(xiàn)大量的焦磷酸鎂鹽白色沉淀產(chǎn)物，經(jīng)瓊脂糖電泳后產(chǎn)生特有的階梯狀分布的擴(kuò)增條帶（圖2），而金黃色葡萄球菌、志賀菌、普通變形桿菌、大腸埃希菌、霍亂弧菌、枯草桿菌、沙門菌DNALAMP擴(kuò)增均無(wú)以上反應(yīng)。

圖2 CP的LAMP反應(yīng)特異性結(jié)果

M.Marker（500 bp）；1.CP；2.金黃色葡萄球菌；3.志賀菌；4.普通變形桿菌；5.大腸埃希菌；6.霍亂弧菌；7.枯草桿菌；8.沙門菌；9.空白對(duì)照

2.2 LAMP檢測(cè)CP敏感性結(jié)果

LAMP方法在DNA稀釋倍數(shù)為107情況下仍可見電泳反應(yīng)結(jié)果，可見LAMP擴(kuò)增核酸為107倍（圖3）。

圖3 CP的LAMP反應(yīng)敏感性結(jié)果

稀釋后濃度1.22.5 ng/μl；2.22.5×10-1 ng/μl；3.22.5×10-2 ng/μl；4.22.5×10-3 ng/μl；5.22.5×10-4 ng/μl；6.22.5×10-5 ng/μl；7.22.5×10-6 ng/μl；8.22.5×10-7 ng/μl；9.22.5×10-8 ng/μl；10.22.5×10-9 ng/μl；M.Marker（500 bp）

2.3 CP雜交結(jié)果

只有CP組出現(xiàn)相應(yīng)的電泳信號(hào)，而其他對(duì)照組無(wú)反應(yīng)結(jié)果（圖2），說(shuō)明LAMP擴(kuò)增CP-DNA的方法具有較高的特異性。將LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物與芯片雜交后，僅CP對(duì)應(yīng)的位置出現(xiàn)雜交信號(hào)，而其他位置無(wú)雜交信號(hào)（圖4），提示芯片雜交技術(shù)同樣具有高度特異性。

圖4 CP雜交結(jié)果掃描圖

3 討論

CP感染在世界各地的發(fā)病率有明顯不同。我國(guó)流行病學(xué)調(diào)查顯示，成人CAP患者中，CP感染明顯高于肺炎支原體（Mycoplasma pneumoniae，MP）及嗜肺軍團(tuán)菌（Legionella pneumoniae，LP），感染率分別是28.1%、3.9%、5.2%[7]。有基礎(chǔ)疾病的老年患者容易感染CP，且并發(fā)肺炎病情較重，常需住院治療，甚至入住ICU。亞洲一項(xiàng)多中心研究表明，CP感染入住ICU的比例較MP及LP明顯增高，入住率分別為16.7%、1.9%、6.6%[8]。CP感染所致的CAP早期臨床癥狀和體征多不典型。傳統(tǒng)的血清學(xué)抗體檢查多適應(yīng)于回顧性診斷，細(xì)菌培養(yǎng)所需時(shí)間較長(zhǎng)，且培養(yǎng)條件苛刻，不能早期指導(dǎo)臨床治療。PCR檢測(cè)技術(shù)發(fā)展迅速，目前已有多重PCR、巢式PCR、實(shí)時(shí)熒光PCR等，可以準(zhǔn)確地檢測(cè)CP，但其對(duì)引物及設(shè)備等要求較高[9]。LAMP技術(shù)是在等溫條件下利用4種特異性引物識(shí)別靶基因的6個(gè)特定穩(wěn)定區(qū)域后進(jìn)行核酸擴(kuò)增，只有靶基因6個(gè)特定區(qū)域與特異性引物正確識(shí)別才能啟動(dòng)LAMP反應(yīng)，反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)生大量的焦磷酸根離子，與鎂離子結(jié)合形成白色的焦磷酸鎂根沉淀[1]。根據(jù)沉淀法、電泳法及熒光法檢測(cè)上述反應(yīng)產(chǎn)物，因此LAMP技術(shù)不僅可以擴(kuò)增靶基因，也能檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物；不僅能鑒別不同類型的病原菌，也能區(qū)分同一病原菌的各種亞型，具有高度特異性。相對(duì)于傳統(tǒng)的PCR，LAMP技術(shù)具有恒溫的優(yōu)點(diǎn)，不會(huì)因改變反應(yīng)溫度而造成時(shí)間浪費(fèi)，且設(shè)備要求簡(jiǎn)單，故具有更簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、快速的特點(diǎn)。

LAMP技術(shù)雖然具有優(yōu)勢(shì)，但也有一定的缺陷，LAMP技術(shù)采用多條引物擴(kuò)增，引物間互補(bǔ)擴(kuò)增可出現(xiàn)假陽(yáng)性，且常規(guī)LAMP技術(shù)只能檢測(cè)一二個(gè)基因。基因芯片是生物芯片的一種類型，是以已知的特定寡核苷酸片段或基因片段作為探針，與未知序列核酸序列進(jìn)行雜交的一種技術(shù)，具有快速、高效、高通量等特點(diǎn)。LAMP擴(kuò)增技術(shù)與基因芯片雜交技術(shù)整合可以實(shí)現(xiàn)兩者的優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，先通過(guò)LAMP反應(yīng)擴(kuò)增靶基因及對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物的初步檢測(cè)，后應(yīng)用基因芯片的熒光探針雜交技術(shù)對(duì)LAMP反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)一步檢測(cè)，不僅可以達(dá)到更高的敏感性和特異性，還能同時(shí)實(shí)現(xiàn)對(duì)多個(gè)樣本的檢測(cè)。目前的聯(lián)合技術(shù)有LAMP與微流控芯片整合的技術(shù)，LAMP與電化學(xué)基因芯片整合的技術(shù)等[10-11]。

總之，本研究應(yīng)用LAMP聯(lián)合基因芯片技術(shù)為快速準(zhǔn)確地檢測(cè)衣原體提供了一種新的方法，其穩(wěn)定性、標(biāo)準(zhǔn)化等問(wèn)題需要通過(guò)更多的研究去解決。

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（收稿日期：2014-08-11 本文編輯：李亞聰）

總之，本研究應(yīng)用LAMP聯(lián)合基因芯片技術(shù)為快速準(zhǔn)確地檢測(cè)衣原體提供了一種新的方法，其穩(wěn)定性、標(biāo)準(zhǔn)化等問(wèn)題需要通過(guò)更多的研究去解決。

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（收稿日期：2014-08-11 本文編輯：李亞聰）

總之，本研究應(yīng)用LAMP聯(lián)合基因芯片技術(shù)為快速準(zhǔn)確地檢測(cè)衣原體提供了一種新的方法，其穩(wěn)定性、標(biāo)準(zhǔn)化等問(wèn)題需要通過(guò)更多的研究去解決。

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（收稿日期：2014-08-11 本文編輯：李亞聰）