熊治渝，董 英*，周洪斌，余 楊，李 靜，孫 莉

（1.江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013；2.國家食品添加劑及調(diào)味品檢測重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 鎮(zhèn)江 212008）

有機(jī)酸及其鹽類化合物由于其結(jié)構(gòu)含有酸根而 有特殊的化學(xué)性質(zhì)，可作為酸化劑、防腐劑等添加于飼料中。有機(jī)酸具有可以改變畜禽腸道微生物菌群，抑制、殺滅有害菌，改善飼料適口性，促進(jìn)礦物質(zhì)和維生素的吸收，提高飼料消化率等功能［1-4］，如今已成為飼料中抗生素最普及的替代品。飼料中添加適量的酸化劑可以促進(jìn)腸道有益菌群如乳酸桿菌的生長繁殖，但添加過少可能起不到酸化日糧的作用，添加過量則會(huì)引起動(dòng)物適口性下降和體內(nèi)代謝的紊亂。我國GB/T 22142-2008明確規(guī)定了飼料中10種有機(jī)酸添加劑的通用要求，因此對(duì)有機(jī)酸種類與含量的監(jiān)控可作為評(píng)價(jià)飼料質(zhì)量的重要指標(biāo)。

已報(bào)道對(duì)有機(jī)酸測定的方法很多，包括酸堿滴定法［5］、分光光度法［6］、毛細(xì)管電泳法［7，8］、色譜法［9］等。上述方法中，由于色譜法最為靈敏、準(zhǔn)確而得到廣泛運(yùn)用，但其也存在不足之處。采用氣相色譜法(GC)［10］和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GCMS)［11］進(jìn)行測定時(shí)，由于大多有機(jī)酸需要進(jìn)行衍生化，因此樣品預(yù)處理較為繁冗，且衍生化反應(yīng)不易定量；采用高效液相色譜法(HPLC)［12-14］及高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(HPLC-MS)［15，16］進(jìn)行測定時(shí)，其流動(dòng)相多含有甲醇、乙腈等有機(jī)溶劑，在一定程度上影響環(huán)境和人體健康，且HPLC多采用紫外檢測器檢測，以保留時(shí)間定性，容易出現(xiàn)假陽性結(jié)果。

目前涉及飼料中有機(jī)酸的研究報(bào)道較少［17-19］。曾有運(yùn)用在線富集的方式，以HPLC-MS/MS檢測磺酰脲和抗生素的報(bào)道［20，21］；也有以在線富集離子色譜法(IC)測定奶粉中碘和硫氰酸鹽的報(bào)道［22］。而以在線富集的方式對(duì)有機(jī)酸進(jìn)行分析測定的方法在國內(nèi)外還未見報(bào)道。本文采用在線富集的方式結(jié)合IC-MS對(duì)樣品中的有機(jī)酸進(jìn)行定性、定量分析，分離速度快，有機(jī)酸檢測靈敏度高，且避免了假陽性結(jié)果的產(chǎn)生。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、材料與試劑

OTS550型無油空氣壓縮機(jī)(臺(tái)州奧突斯工貿(mào)有限公司)；Haskel AW-60高壓勻漿裝柱系統(tǒng)(天津倍思樂色譜技術(shù)開發(fā)中心)；20 mm×4.6 mm色譜柱管和250 mm×1.0 mm色譜柱管(進(jìn)口柱，北京瑞景澤佑公司)；5 μm的以硅膠為基質(zhì)的帶氨丙基的弱陰離子交換填料及5 μm的以硅膠為基質(zhì)的帶季銨鹽的強(qiáng)陰離子交換填料、30 μm的惰性材料(本實(shí)驗(yàn)室制備)；200 μL定量環(huán)(本實(shí)驗(yàn)室制備)；Dionex ICS-3000型離子色譜儀(美國戴安公司)，配有Dionex AS自動(dòng)進(jìn)樣器、ASRS 3004-mm抑制器、DS60電導(dǎo)檢測器、Chromeleon 6.8色譜工作站；自制富集柱和自制分離柱；MSQ質(zhì)譜儀(Thermo Scientific公司)，配大氣壓化學(xué)電離源(APCI)、Dionex AXP-MS獨(dú)立泵；XW-80A渦旋混合器(上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠)；H-2050R高速冷凍離心機(jī)(長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司)；水相針式濾器(SCAA-101，上海安譜科學(xué)儀器有限公司)；Milli-Q超純水一體機(jī)(Millipore公司)。

乙腈、甲醇(德國Merck公司)；50%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氫氧化鈉(NaOH)溶液。16種有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品:乳酸、磷酸、檸檬酸、草酸、蘋果酸、焦谷氨酸、甲酸、丙酮酸、丁二酸、D-酒石酸、丙二酸、馬來酸、富馬酸、α-酮戊二酸、D-奎尼酸、反-烏頭酸(純度 ＞99%，北京瑞景澤佑公司)。

1.2 溶液配制

16種有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液和工作液:準(zhǔn)確稱取適量的16種有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品，用超純水配制成2000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，置于4℃冰箱中保存。用超純水將16種有機(jī)酸儲(chǔ)備液稀釋成不同質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3 分離柱與富集柱的制備

分離柱:將250 mm×1.0 mm空色譜柱管與高壓勻漿裝柱系統(tǒng)中轉(zhuǎn)換柱相連。在無油空氣壓縮機(jī)的作用下，用甲醇將甲醇溶解超聲后的混合填料(弱陰離子、強(qiáng)陰離子交換填料按1∶2(質(zhì)量比)混合)裝入分離柱，裝柱壓力控制在13.79 MPa。結(jié)束后將分離柱與轉(zhuǎn)化柱分離，并迅速裝上篩板，以防止柱內(nèi)填料自動(dòng)擠出，造成柱內(nèi)填料的自然塌陷。

富集柱:富集柱(20 mm×4.6 mm)的制備過程與分離柱相似。不同的是富集柱填料為帶季銨鹽的強(qiáng)陰離子交換填料，且兩端各添加了0.2 cm厚耐酸堿的惰性材料。裝柱壓力控制在10.34 MPa。

1.4 樣品前處理

精確稱取市售飼料添加劑樣品0.2 g于10 mL離心管中，加入2 mL正己烷飽和的乙腈和1 mL水，渦旋混勻后高速冷凍離心(5000 r/min，-15℃)20 min，取500 μL清液于試管中，氮?dú)獯蹈珊蠹铀畯?fù)溶，過0.45 μm水相濾膜備用。

1.5 IC-MS 條件

色譜柱:自制分離柱和富集柱。淋洗液:NaOH溶液。梯度洗脫程序:0～3 min，0～10.0 mmol/L(線性梯度)；3～5 min，10.0 mmol/L；5～10 min，10.0～20.0 mmol/L；10～15 min，20.0～30.0 mmol/L；15～18 min，30.0～40.0 mmol/L；18～21 min，40.0～50.0 mmol/L；21～24 min，50.0～60.0 mmol/L；24～26.5 min，60～80.0 mmol/L；26.5～35 min，0.0 mmol/L。梯度泵流速:0.45 mL/min(分離柱淋洗液)。恒流泵流速:1.0 mL/min(為抑制器提供水源)。ASRS 3004-mm抑制器電流:151 mA。進(jìn)樣量:200.0 μL。獨(dú)立泵供水流速:0.7 mL/min。富集時(shí)間:3 min。

質(zhì)譜采用APCI負(fù)離子化模式；離子源溫度450℃；霧化氣為氮?dú)?純度為 99.9%、壓力 379.2 kPa)。各有機(jī)酸的特征離子、保留時(shí)間參數(shù)見表1。

表1 16種有機(jī)酸的IC-MS檢測參數(shù)Table 1 IC-MS parameters for the 16 organic acids

1.6 IC-APCI-MS 分析

如圖1所示，自動(dòng)進(jìn)樣器通過六通閥A的6號(hào)位向定量環(huán)中注入200 μL樣品溶液(一般情況下進(jìn)樣量為20 μL)；六通閥A切換，由獨(dú)立泵帶動(dòng)純水以0.7 mL/min的流速將定量環(huán)中的樣液推入六通閥B的6號(hào)位至富集柱，在線富集3 min；然后六通閥B切換，由四元梯度泵帶動(dòng)NaOH淋洗液以0.45 mL/min的流速將富集柱內(nèi)樣品推向分離柱；樣品經(jīng)分離柱分離后進(jìn)入抑制器，再進(jìn)入DS60電導(dǎo)檢測器，最后進(jìn)入MS檢測。MS采用APCI源負(fù)離子模式，對(duì)m/z 20～500范圍進(jìn)行全掃描。循環(huán)時(shí)間0.2 s，錐孔電壓40 V，離子源溫度450℃。

圖1 在線富集離子色譜-質(zhì)譜聯(lián)用裝置Fig.1 On-line enrichment system of IC-MS

2 結(jié)果與討論

2.1 自制柱評(píng)價(jià)

分離柱制備完成后，將其連接于流動(dòng)相為純水的獨(dú)立泵上，控制水的流速恒定，清洗柱內(nèi)甲醇，并觀察色譜柱壓力的變化情況。觀察顯示，當(dāng)流速為1 mL/min時(shí)，柱壓保持13.34 MPa不變。這表明柱填料的緊密性較好。將分離柱連接在離子色譜上，以NaOH溶液為淋洗液，進(jìn)樣20 μL有機(jī)酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，觀察質(zhì)譜信號(hào)圖，顯示16種有機(jī)酸均有信號(hào)響應(yīng)；連續(xù)進(jìn)樣5個(gè)不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，發(fā)現(xiàn)各有機(jī)酸的出峰時(shí)間保持相對(duì)穩(wěn)定(RSD＜0.5%，n=5)，表明柱填料對(duì)有機(jī)酸具有保留吸附的能力，且填料緊密性高，沒有發(fā)生塌陷。對(duì)于富集柱，采用類似的方法對(duì)其進(jìn)行評(píng)價(jià)。發(fā)現(xiàn)當(dāng)流速為0.7 mL/min時(shí)，柱壓保持10.11 MPa相對(duì)穩(wěn)定。離子色譜添加富集柱后，采用大體積(200 μL)進(jìn)樣，發(fā)現(xiàn)有質(zhì)譜峰響應(yīng)，說明富集柱對(duì)有機(jī)酸有吸附性。分別對(duì)分子結(jié)構(gòu)含有不同羧基數(shù)的乳酸、馬來酸、檸檬酸進(jìn)行高濃度(2000 mg/L)進(jìn)樣，對(duì)比發(fā)現(xiàn)與低濃度(1 mg/L)進(jìn)樣時(shí)的保留時(shí)間相差不大(見表2)。這表明富集柱對(duì)有機(jī)酸有較強(qiáng)的吸附能力且填料緊密性好。3種有機(jī)酸的保留時(shí)間不同，可能是柱填料對(duì)有機(jī)酸的吸附能力與其分子結(jié)構(gòu)含有的不同羧基數(shù)有關(guān)。而高濃度檸檬酸與低濃度檸檬酸相比，保留時(shí)間相同。可能原因是進(jìn)樣檸檬酸濃度太大，目標(biāo)化合物沒有得到充分保留，致使樣品分子提前流出色譜柱，造成化合物響應(yīng)峰前移；而濃度過高又造成峰寬變大，致使峰保留時(shí)間與低濃度一致。

表2 低濃度與高濃度有機(jī)酸分析的保留時(shí)間比較Table 2 Comparison of retention times of the organic acids in low concentration and high concentration

2.2 IC-MS條件的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)過程中，水溶液可以在1 min內(nèi)以0.7 mL/min的流速將樣品從200 μL定量環(huán)推向富集柱內(nèi)。選擇富集時(shí)間為3 min可以將樣品最大程度地帶向富集柱，同時(shí)實(shí)現(xiàn)富集過程中水對(duì)樣品的在線清洗，去除樣品中部分雜質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)中離子色譜采用NaOH溶液為淋洗液，選擇0.45 mL/min的淋洗流速使整個(gè)管路壓力保持在安全承受范圍(＜20.69 MPa)。當(dāng)采用70 mmol/L的NaOH溶液等度洗脫有機(jī)酸時(shí)，盡管全部出峰時(shí)間較短，但各峰之間的分辨率較差，分離度不好，如乳酸和草酸、奎尼酸和檸檬酸等相對(duì)分子質(zhì)量相近的有機(jī)酸則不能被很好地分開，馬來酸與富馬酸互為同分異構(gòu)體，幾乎完全不能分開。而采用梯度洗脫，則能將各種有機(jī)酸完全分開。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間，柱壓保持相對(duì)穩(wěn)定，有機(jī)酸出峰時(shí)間相對(duì)穩(wěn)定。

分別對(duì)質(zhì)譜電噴霧離子(ESI)源和APCI源進(jìn)行了測試。發(fā)現(xiàn)相同條件下，采用ESI源分析有機(jī)酸時(shí)，質(zhì)譜沒有相應(yīng)的響應(yīng)信號(hào)；而采用APCI源負(fù)離子模式時(shí)，質(zhì)譜信號(hào)明顯。采用負(fù)離子模式可使有機(jī)酸結(jié)構(gòu)離子化，以［M-H］-的形式存在。

質(zhì)譜錐孔電壓對(duì)有機(jī)酸的峰值靈敏度有較大的影響。分別考察了錐孔電壓為20、40、50、70 V時(shí)對(duì)16種有機(jī)酸的分析結(jié)果的影響，發(fā)現(xiàn)錐孔電壓為40 V時(shí)14種有機(jī)酸(乳酸、磷酸、檸檬酸、草酸、蘋果酸、焦谷氨酸、甲酸、丙酮酸、丁二酸、D-酒石酸、丙二酸、馬來酸、富馬酸、α-酮戊二酸)的峰面積最大，從而確定這14種有機(jī)酸的最佳錐孔電壓都為40 V。另外，D-奎尼酸的最佳錐孔電壓為70 V，反-烏頭酸的最佳錐孔電壓為20 V。在以上優(yōu)化條件下，得到16種有機(jī)酸的選擇離子監(jiān)測圖(見圖2)。

圖2 16種有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品的IC-APCI-MS選擇離子監(jiān)測色譜圖Fig.2 SIM chromatograms of the 16 organic acid standards by IC-APCI-MS

2.3 線性關(guān)系、檢出限及定量限

在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，對(duì)一系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測定，以峰面積(y)為縱坐標(biāo)，有機(jī)酸質(zhì)量濃度(x，mg/L)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸；以S/N=3和S/N=10分別確定各有機(jī)酸在樣品中的檢出限(LOD)和定量限(LOQ)，結(jié)果見表3。結(jié)果表明，各有機(jī)酸在一定濃度范圍內(nèi)的線性關(guān)系良好(R2≥0.988)，方法的LOD為0.01～0.22 mg/L，LOQ為0.03～0.80 mg/L，表明所建立的方法靈敏度較高，可對(duì)有機(jī)酸含量較低的樣品進(jìn)行檢測。

2.4 回收率及精密度

在A、B兩種市售飼料添加劑樣品中分別添加不同水平的有機(jī)酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.4節(jié)方法處理并按1.5節(jié)條件測定，每一加標(biāo)水平平行測定6次，計(jì)算平均回收率。由表4可見16種有機(jī)酸的加標(biāo)平均回收率為70.6%～110.8%，RSD≤6.3%。結(jié)果表明，在不同的加標(biāo)水平下，16種有機(jī)酸的回收率較為穩(wěn)定，精密度良好，滿足樣品中有機(jī)酸的分析要求。表5為兩個(gè)樣品中有機(jī)酸含量的測定結(jié)果。

表3 16種有機(jī)酸的線性關(guān)系、檢出限和定量限Table 3 Linear relationships，limits of detection(LODs，S/N=3)and limits of quantification(LOQs，S/N=10)of the 16 organic acids

表4 16種有機(jī)酸的加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)Table 4 Recoveries and RSDs of the 16 organic acids spiked in the samples(n=6)

表4 (續(xù))Table 4 (Continued)

表5 兩個(gè)樣品中16種有機(jī)酸的含量(n=3)Table 5 Contents of 16 organic acids in two samples(n=3)

3 結(jié)論

本研究建立了一種可同時(shí)快速測定飼料添加劑中16種有機(jī)酸的在線富集離子色譜-質(zhì)譜分析方法。自制富集柱和分離柱對(duì)有機(jī)酸表現(xiàn)出較好的富集能力和分離能力；采用大體積進(jìn)樣，樣品檢測靈敏度較高；采用質(zhì)譜對(duì)有機(jī)酸定性，避免了假陽性結(jié)果的出現(xiàn)。此外，在線富集方式能對(duì)樣品進(jìn)行在線清洗，避免雜質(zhì)對(duì)色譜柱的污染，減少了樣品雜質(zhì)對(duì)有機(jī)酸峰值靈敏性的影響。16種有機(jī)酸能在30 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)完全分離。該方法的流動(dòng)相中不含甲醇、乙腈等有機(jī)溶劑，在一定程度上減少了對(duì)環(huán)境及人體健康的影響。該方法可應(yīng)用于飼料中有機(jī)酸添加劑的檢測監(jiān)控。

［1］Chen C Y，Wang T.Feed Research(陳才勇，王恬.飼料研究)，2004(1):37

［2］Chen Y，Zhen L.China Feed(陳勇，甄莉.中國飼料)，2004(9):30

［3］Ma J F，Ma Y L.Feed Industry(馬吉鋒，馬玉龍.飼料工業(yè))，2005，26(10):17

［4］Li C L，Zhou A G，Wang Z S.Feed Industry(李成良，周安國，王之盛.飼料工業(yè))，2006，27(11):35

［5］Liu X T，Zhang W M，Jiang H F，et al.Food Research and Development(劉曉棠，張衛(wèi)明，姜洪芳，等.食品研究與開發(fā))，2010，31(1):100

［6］Niu J G，Liang X J，Liu X，et al.Chinese Journal of Applied Chemistry(牛金剛，梁曉靜，劉霞，等.應(yīng)用化學(xué))，2010，27(3):342

［7］Tang Y J，Wu M J.Food Chem，2007，103:243

［8］Han H F，Wang Q，Liu X，et al.Chinese Journal of Chromatography(韓海峰，王慶，劉霞，等.色譜)，2012，30(5):538

［9］Uckoo R M，Jayaprakasha G K，Nelson S D，et al.Talanta，2011，839:48

［10］Yang M H，Choong Y M.Food Chem，2001，75:101

［11］Koubaa M，Cocuron J C，Thomasset B，et al.Anal Biochem，2013，436:151

［12］Qureshi M S，Bhongale S S，Thorave A K.J Chromatogr A，2011，1218:7147

［13］Barros L，Pereira C，F(xiàn)erreira I C F R.Food Anal Method，2013，6:309

［14］Ma R，Ouyang J，Li X，et al.Chinese Journal of Chromatography(馬瑞，歐陽嘉，李鑫，等.色譜)，2012，30(1):62

［15］Scherer R，Rybka A C P，Ballus C A，et al.Food Chem，2012，135:150

［16］Ehling S，Cole S.J Agric Food Chem，2011，59:2229

［17］Fu T，Liu Q S，F(xiàn)an Z Y，et al.China Animal Husbandry and Veterinary Medicine(傅彤，劉慶生，范志影，等.中國畜牧獸醫(yī))，2005，32(5):16

［18］Liu X，Zheng T，Shi C O，et al.China Feed(劉霞，鄭婷，施超歐，等.中國飼料)，2009(8):39

［19］Zheng T，Cai Y X，Liu X，et al.Chinese Journal of Analysis Laboratory(鄭婷，蔡玉興，劉霞，等.分析試驗(yàn)室)，2009，28(Suppl):230

［20］Losito I，Amorisco A，Carbonara T，et al.Anal Chim Acta，2006，575:89

［21］Dinh Q T，Alliot F，Moreau-Guigon E，et al.Talanta，2011，85:1238

［22］Niemann R A，Anderson D L.J Chromatogr A，2008，1200:193