劉奕　費偉　王麗娜　等

[摘要] 目的 評價人工合成抗菌肽（十肽）對口腔常見感染性疾病主要致病菌的抑菌活性。方法 采用瓊脂擴散法及液體稀釋法體外評價十肽對變異鏈球菌、表兄鏈球菌、嗜酸乳桿菌、血鏈球菌、格氏鏈球菌、黏性放線菌、內(nèi)氏放線菌、牙齦卟啉單胞菌、中間普雷沃菌、具核梭桿菌、伴放線嗜血桿菌及白色假絲酵母菌的抑菌性能，并測定十肽對變異鏈球菌的時間-殺菌曲線。結果 十肽對所選實驗菌株均表現(xiàn)出不同的抑菌性能，對主要致齲菌的最小抑菌濃度MIC值為62.5～125 μg·mL-1，而對主要牙周致病菌的MIC值為250～1 000 μg·mL-1，其中，十肽對齲病主要致病菌變異鏈球菌有較強抑菌作用。時間-殺菌曲線結果顯示，十肽作用20 min后開始殺菌，30 min之后可完全殺滅細菌，且在24 h之內(nèi)無細菌生長。結論 新型人工合成抗菌肽十肽對口腔常見感染性疾病主要致病菌具有抑菌性能，其中對致齲變異鏈球菌的抑菌效果最為明顯。

[關鍵詞] 十肽； 抗菌性能； 口腔感染性疾病

[中圖分類號] R 780.2 [文獻標志碼] A [doi] 10.7518/hxkq.2014.06.017

齲病是在以細菌為主的多種因素作用下，發(fā)生在牙體硬組織的慢性、進行性破壞的疾病，齲病及其繼發(fā)疾病給人類造成很大的危害，被世界衛(wèi)生組織列為人類重點防治的非傳染性疾病。變異鏈球菌（Streptococcus mutans，S. mutans）是與齲病發(fā)生密切相關的主要致病菌，也是牙菌斑生物膜中重要的定植菌。十肽（decapeptide）是從多肽庫中篩選出來的一種人工合成的新型抗菌肽，具有較強的抗微生物活性，且作用過程中不產(chǎn)生耐藥性。十肽氨基酸序列為KKVVFKVKFK-NH2，其具有的單一氨基酸序列是其主要部分[1]。本研究旨在研究十肽抑制口腔感染性疾病主要致病菌生長的能力，體外評價十肽的抑菌防齲性能，為進一步探索十肽抑制細菌，防止早期菌斑形成的作用機制奠定實驗基礎。

1 材料和方法

1.1 十肽的合成

依據(jù)十肽的氨基酸序列，采用人工固相多肽合成的方法體外合成十肽并進行質(zhì)譜鑒定（成都誠諾新技術有限公司合成并鑒定）。

1.2 主要儀器和設備

標準96孔微量板（Sigma公司，美國），光學顯微鏡（Nikon公司，日本），ProtoCOL SR 全自動抑菌環(huán)測量儀（Synbiosis公司，英國），CrystalSpecTM比濁儀（Becton Dickinson公司，美國），針孔式濾膜過濾器（孔徑：0.2 μm，無錫賽維商貿(mào)公司），厭氧培養(yǎng)箱DY-2（浙江義烏冷凍機總廠），超凈工作臺（蘇州凈化設備有限公司），高壓蒸汽滅菌機（Sanyo公司，日本）。

1.3 實驗菌株

變異鏈球菌ATCC 25175、表兄鏈球菌6715、嗜酸乳桿菌ATCC 4356、血鏈球菌ATCC 10556、格氏鏈球菌ATCC 10558、黏性放線菌ATCC 19246、內(nèi)氏放線菌ATCC 12140、牙齦卟啉單胞菌381、中間普雷沃菌ATCC 25611、具核梭桿菌10953、伴放線放線桿菌29523、白色假絲酵母菌ATCC 10691均由四川大學口腔疾病研究國家重點實驗室提供。

1.4 實驗菌株的培養(yǎng)

變異鏈球菌、表兄鏈球菌、格氏鏈球菌、血鏈球菌、黏性放線菌、內(nèi)氏放線菌采用TPY培養(yǎng)基培養(yǎng)；嗜酸乳桿菌采用Rogosa培養(yǎng)基培養(yǎng)；牙齦卟啉單胞菌、中間普雷沃菌、具核梭桿菌、伴放線放線桿菌采用BHI培養(yǎng)基培養(yǎng)；白色假絲酵母菌采用BA培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.5 方法

1.5.1 十肽實驗液的配制 將人工合成的十肽重懸于無菌雙蒸水，終濃度為4 g·L-1，針孔式濾膜過濾器過濾，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2 菌懸液的配制 實驗菌種凍干株接種于相應

固體培養(yǎng)基上復蘇，于80%N2、10%H2、10%CO2，37 ℃下厭氧培養(yǎng)24～48 h，白色假絲酵母菌于恒溫培養(yǎng)箱37 ℃需氧培養(yǎng)24 h。檢查菌落的生長形態(tài)，鏡檢無污染，涂片檢查證實為純培養(yǎng)后，挑取單個菌落于液體培養(yǎng)基中在相同的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)增菌，CrystalSpecTM比濁儀測定菌懸液濃度，磷酸緩沖液（PBS）配制濃度為1×108 CFU·mL-1和2×106 CFU·mL-1的細菌菌懸液備用。

1.5.3 瓊脂擴散實驗 實驗分為陽性對照組（0.1%氯己定）、陰性對照組（PBS緩沖液）、實驗組（4 g·L-1的十肽實驗液）。采用瓊脂擴散的方法，制備含菌的培養(yǎng)基，微量加樣槍吸取濃度為1×108 CFU·mL-1的菌懸液各200 μL加入20 mL培養(yǎng)基中，充分混勻，鋪板（培養(yǎng)皿直徑90 mm），使細菌菌懸液最終濃度為1×106 CFU·mL-1，平均劃分3個加樣區(qū)，打孔器均勻制備加樣孔（直徑約3 mm），分別加入0.1%的氯己定、PBS緩沖液及4 g·L-1的十肽實驗液各5 μL，培養(yǎng)24～48 h，ProtoCOL SR全自動抑菌環(huán)測量儀測量抑菌環(huán)直徑大小，每種細菌設置6個平行對照組。

1.5.4 最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentra-tion，MIC）及最小殺菌濃度（minimum bactericidal concentration，MBC）的測定 實驗分為陽性對照組（含0.1%氯己定的菌懸液培養(yǎng)基）、陰性對照組（含PBS的菌懸液培養(yǎng)基）、實驗組（含不同濃度的十肽菌懸液培養(yǎng)基）。以上各組均設置3個平行組。使用液體稀釋法對MIC和MBC進行測定，將濃度為4 g·L-1的十肽實驗液按對倍稀釋溶于液體培養(yǎng)基中，使其終濃度為2 g·L-1、 1 g·L-1、500 μg·mL-1、250 μg·mL-1、125 μg·mL-1、62.5 μg·mL-1、31.3 μg·mL-1、15.6 μg·mL-1。濃度為2×106 CFU·mL-1菌懸液與各組藥液按比例1∶1各100 μL，分別接種于無菌96孔板中，使菌懸液的終濃度為1×106 CFU·mL-1，置于適當?shù)呐囵B(yǎng)條件下培養(yǎng)24～48 h。在黑色背景下，凡肉眼觀察微孔內(nèi)液體清亮無渾濁或沉淀生長的最低藥物濃度為十肽的MIC。用無菌接種環(huán)分別挑取肉眼觀察無細菌生長的微孔板中的培養(yǎng)物20 μL，劃線接種于固體培養(yǎng)基上，相同條件下培養(yǎng)，觀察菌落數(shù)少于5～6個的最低濃度為最小殺菌濃度（MBC）值[2-3]。所有菌種的MIC測定實驗重復3次。

1.5.5 十肽對變異鏈球菌時間-殺菌曲線的測定 實驗分為陽性對照組（含0.1%氯己定的TPY液體培養(yǎng)基）、陰性對照組（TPY液體培養(yǎng)基）、實驗組（含MBC濃度的十肽的TPY液體培養(yǎng)基）。將200 μL的變異鏈球菌菌懸液分別加入實驗組、陽性對照組及陰性對照組中，菌懸液與TPY液體培養(yǎng)基的比例為

1︰9，變異鏈球菌的終濃度為1×106 CFU·mL-1，37 ℃兼性厭氧培養(yǎng)，分別培養(yǎng)0、10、20、30 min，及1、2、4、8、24 h提取菌液。PBS緩沖液梯度稀釋（0、10、100、1 000倍）后取50 μL菌懸液接種于TPY固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)24～48 h后計數(shù)菌落數(shù)。以時間為橫坐標，菌落形成單位數(shù)（CFU·mL-1）的對數(shù)值（log）為縱坐標，繪制時間-殺菌曲線?；罹嫈?shù)減少99.9%即差異>3 log CFU·mL-1者視為有殺菌作用，活菌計數(shù)下降1～3 log CFU·mL-1者視為有抑菌作用[2，4]。實驗重復3次，取平均值。

1.6 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 13.0軟件對抑菌環(huán)直徑行配對t檢驗分析。

2 結果

2.1 十肽的合成分析結果

質(zhì)譜分析十肽相對分子質(zhì)量為1 249.958，與理論相對分子質(zhì)量的1 249.7基本一致，誤差小于2‰。高效液相色譜分析十肽純度為98.22%。

3 討論

抗菌肽是一類對抗外界病原體感染的肽類活性物質(zhì)，它們多為12～50個氨基酸組成的短肽[5]?？咕淖钪匾?、最引人關注的生物學活性是其高效廣譜的抗微生物活性，其抗菌作用具有以下特點：抗菌譜廣，對革蘭陽性、陰性菌都表現(xiàn)出較強的抗菌作用；殺菌快速；不易產(chǎn)生耐藥性，已經(jīng)在臨床上得到廣泛應用?？咕牡臍⒕绞蕉喾N多樣，主要作用機制包括：細胞膜攻擊作用、線粒體攻擊作用、對染色體的破壞作用、干擾細菌代謝或直接作用于胞漿成分、促進調(diào)亡相關蛋白及配體的表達、影響DNA的復制和轉錄[6-7]。但是，人們對其確切的殺菌機制尚缺乏足夠的認識。

在多肽菌庫中，新型抗菌肽十肽被證明有較強的抗菌作用。體外細胞毒性實驗表明，當十肽的濃度增加到1 g·L-1的高濃度時也不會導致人牙齦成纖維細胞死亡且仍能使細胞膜保持較完整的結構。研究進一步證明十肽的作用只針對原核生物界，對哺乳動物細胞并無毒性[8]。研究[9]發(fā)現(xiàn)十肽對金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大腸埃希菌、普通變形桿菌、恥垢分支桿菌、白喉桿菌、弗氏志賀菌等都有較強的抑菌殺菌作用，并且主要是通過改變細菌生物膜上的結構實現(xiàn)的。進一步研究發(fā)現(xiàn)在利用雙重的流動細胞系統(tǒng)技術構建人工合成的生物膜中，十肽作用后能使成熟的生物膜斷裂，以有效地阻滯早期牙菌斑生物膜的形成，提示在傳統(tǒng)的牙膏中加入十肽可能會通過阻斷牙菌斑的形成從而抑制齲病的發(fā)生。在以往對十肽作用機制的研究中發(fā)現(xiàn)，由于十肽具有陽離子殘基及親水性的特性，認為它的抗菌機制可能是：十肽的雙親性α-螺旋結構上的正電荷與細菌細胞膜上負電荷之間通過靜電吸引而結合并聚集在質(zhì)膜上，打亂了質(zhì)膜上的脂質(zhì)和蛋白質(zhì)原有的排列秩序，從而導致細胞膜的結構紊亂，最后殺滅細菌。但是其確切的抑菌機制尚不清楚[4，10-12]。

本實驗依據(jù)十肽的氨基酸序列，采用人工固相多肽合成的方法體外合成十肽。此法的基本過程是：將目標多肽的C-端羧基以共價鍵形式與一個不溶性的高分子樹脂相連，然后以這個氨基酸的氨基作為起點，與另一分子氨基酸的羧基作用（用DCC作偶聯(lián)劑）形成肽鍵。不斷重復這一過程，即可以得到目標多肽產(chǎn)物。合成反應完成后，去除保護基，將肽鏈與樹脂分離，即得到目標產(chǎn)物。該法節(jié)省了分離純化的時間，反應效率高，產(chǎn)物純度高。十肽合成后，通過高效液相色譜檢測其純度。以往研究表明抗菌肽的純度大于80%即可以發(fā)揮抑菌作用。本次實驗合成十肽的純度高于98%，既保證了十肽本身的抑菌性能，又基本排除了雜質(zhì)對實驗的干擾，保證了實驗的科學性。

本實驗采用美國國立臨床實驗室標準化委員會（National Committee for Clinical Laboratory Standards，NCCLS）推薦的藥物敏感試驗瓊脂擴散法觀測十肽對實驗菌株抑菌環(huán)大小，實驗中使用全自動抑菌環(huán)測量儀測量抑菌環(huán)直徑大小，在一定程度上避免了人工測量引起的誤差，具有一定的實用性。為了進一步測試實驗菌株對十肽的敏感性，本實驗使用了敏感的液體稀釋法觀測十肽的抑菌性能，方法易于掌握，結果重復性好。結果表明：十肽對口腔常見致齲菌的MIC為62.5～500 μg·mL-1，該結果與Concan-non等[13]的研究有一定的區(qū)別。這可能與所選用的菌懸液濃度及所選菌種不同有關，本實驗選用的實驗菌株均為四川大學華西口腔醫(yī)學院微生物實驗室保存的標準菌株，實驗中并未選擇臨床菌株，旨在對十肽對口腔細菌的抗菌性能進行初步評價，篩選出抑菌效果最好的菌株進行后續(xù)研究。此外，本實驗還評價了十肽對牙周病主要致病菌的影響，研究結果表明十肽對革蘭陰性專性厭氧菌也表現(xiàn)出較明顯的抑制作用，但其抑菌性弱于主要致齲菌，造成十肽對革蘭陽性菌和革蘭陰性菌的不同抑菌性能的機制目前尚不清楚。但是以往的研究結果發(fā)現(xiàn)，由于十肽具有陽離子殘基及親水性，它的抗菌機制可能主要包括靜電學說、氫鍵或與細菌生物膜表面的膜受體的疏水性作用，進而破壞細菌生物膜，因此，本課題組將對這種抑菌機制的差異及十肽對口腔主要致齲菌生物膜生長的影響進行深入的研究。時間-殺菌曲線是一項評價抗菌藥抗菌活性的實驗，用這種方法可以評價抗菌藥物抗菌效力的強弱，為臨床擇藥提供依據(jù)。通過觀察十肽對變異鏈球菌生長的時間-殺菌曲線發(fā)現(xiàn)，十肽作用20 min后開始殺菌，30 min之后可完全殺滅細菌，且在24 h之內(nèi)無細菌生長。研究證明十肽能在較短時間內(nèi)殺滅變異鏈球菌，并提示十肽可能具有抗生素后效應（即指細菌與抗生素或抗菌藥物，經(jīng)短時間接觸，將殘留抗生素清除后，細菌生長仍受抑制的生物現(xiàn)象）。由此研究結果推測，將來臨床應用中將十肽用于口內(nèi)局部用藥，通過短時間的藥物接觸后能持續(xù)抑制口腔變異鏈球菌生長，可能初步達到防齲目的。

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（本文編輯 杜冰）