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        大孔吸附樹脂HP20分離肉桂原花青素的研究

        2014-10-21 17:35:17姜倩張加研秦永劍劉祖廣
        安徽農(nóng)業(yè)科學(xué) 2014年31期
        關(guān)鍵詞:聚體聚合度肉桂

        姜倩 張加研 秦永劍 劉祖廣

        摘要 [目的]研究HP-20大孔吸附樹脂分離肉桂原花青素。[方法]采用HP-20大孔吸附樹脂分離肉桂原花青素,將1 g原花青素原料溶解在少量60%乙醇中,制得的濃溶液勻速加入吸附柱中,分別用20%、40%、60%、80%、100%的乙醇對吸附在樹脂上的肉桂原花青素進(jìn)行梯度洗脫,并分析各部分質(zhì)量、純度以及聚合度。[結(jié)果]各部分樣品分別標(biāo)記為F20、F40、F60、F80、F100,五部分的質(zhì)量分別為0.24、0.19、0.17、0.27、0.02 g;五部分中,純度最高的為F40部分,純度為82.65%,純度最低的為F100部分,純度為65.11%;洗脫過程中原花青素回收率達(dá)89%;分析各濃度的乙醇洗脫液中原花青素平均聚合度發(fā)現(xiàn),10%~40%乙醇洗脫液中主要為低聚體,而40%~100%乙醇洗脫液中主要為高聚體。[結(jié)論]該研究為下一步肉桂原花青素高聚體的降解后的分離提供理論依據(jù)。

        關(guān)鍵詞 原花青素;大孔吸附樹脂HP-20;分離;聚合度

        中圖分類號 S567 文獻(xiàn)標(biāo)識碼

        A 文章編號 0517-6611(2014)31-10919-03

        Study on the Separation of Cinnamon Proanthocyanidins by Macroporous Resin HP-20

        JIANG Qian1,ZHANG Jiayan1*,QIN Yongjian1 et al (College of Material Engineering,Southwest Forestry University,Kunming,Yunnan 650224)

        Abstract [Objective] The research aimed to study study the separation of proanthocyanidins by macroporous resin HP-20.[Method]The starting material 1 g of procyanidin was dissolved in a small amount of 60% ethanol,the concentrated solution was added to adsorption column in a constant speed.Ethanol concentration of 20%,40%,60%,80%,100% was selected respectively in gradient eluting by macroporous resin HP-20,and the quality,purity,and polymerization degree of all parts of the samples were analyzed.[Result]Each parts of the samples were labeled F20、F40、F60、F80、F100,the quality of five parts was 0.24 ,0.19,0.17,0.27 and 0.02 g separately.In the five parts,the highest purity was F40,and its purity is 82.65%,the lowest purity was F100,its purity was 65.11%.The recovery rate of Proanthocyandins elution was 89%.Analysis of the average polymerization degree of proanthocyanidins in the concentrations of ethanol eluate found that the 10%-40% ethanol eluate contained mainly OPC,40%-100% ethanol eluate contained mainly PPC.[Conclusion] The study provides the theoretical basis for the next study for separation of polymeric proanthocyanidins from cinnamon.

        Key words Proanthocyanidins;Macroporous resin HP-20;Separation;Polymerization degree

        肉桂為樟科植物肉桂的干燥樹皮[1],肉桂具有解痙止痛、解熱、擴張血管、抗菌、抗腫瘤及促進(jìn)免疫等藥理作用[2]。肉桂原產(chǎn)于斯里蘭卡,該地產(chǎn)量約占世界總產(chǎn)量的70%,中國、東南亞以及世界許多熱帶地區(qū)均有栽種。我國肉桂的生產(chǎn)總量占世界的38.1%,主要分布于廣西、云南、福建、海南等省份[3],而廣西、廣東兩省肉桂產(chǎn)量占我國肉桂產(chǎn)量的95%以上[4]。原花青素按照聚合度的大小,通常將二~四聚體稱為低聚原花青素(OPC),五聚體以上的稱為多聚原花青素(PPC),OPC與PPC相比,OPC在抗氧化、酶抑制、預(yù)防心血管疾病、抗癌、抗炎止痛、止血、增進(jìn)免疫調(diào)節(jié)以及促進(jìn)心臟缺血后復(fù)蘇、防止動脈硬化、減少對皮膚的刺激和抗糖尿病等方面有顯著的生物活性[5],其在體內(nèi)的抗氧化能力是VE的50倍、Vc的20倍[6]。Gu等對41種食品中原花青素的含量進(jìn)行評價,發(fā)現(xiàn)肉桂中原花青素含量最高,但其中高聚原花青素占49.3%,低聚原花青素占50.0%,多聚原花青素由于受到空間位阻的影響,生物活性降低[7]。因此為了有效發(fā)揮原花青素的抗氧化性,對原花青素進(jìn)行分級處理,富集原花青素低聚體成分,能夠提高原花青素生物功效。該試驗采用資源豐富的廣西肉桂皮為原材料,研究大孔吸附樹脂HP20對肉桂原花青素按聚合度進(jìn)行分離,為下一步肉桂原花青素高聚體降解后的分離提取提供參考。

        1 材料與方法

        1.1 試驗材料

        無水乙醇、甲醇、香草醛、鹽酸(分析純,上海國藥集團(tuán)有限公司),(+)-兒茶素、(-)-表兒茶素、原花青素(國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)檢定所)、2-巰基乙醇、TU1810DASP C型紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)、Agilent 1200series 高效液相色譜儀、BS-100A自動部分接收器、大孔吸附樹脂HP20(北京慧德易科技有限責(zé)任公司)。

        1.2 肉桂原花青素的制備

        稱取5.04 g(80~120目)肉桂皮粉末于500 ml三口燒瓶中,再向三口燒瓶中加入150 ml 60%乙醇,置于預(yù)先預(yù)熱的50 ℃恒溫水浴鍋中,安裝好冷凝管、磁力攪拌器攪拌,啟動攪拌裝置提取1.5 h,隨后取出燒瓶并冷卻至室溫,過濾后,濾液利用石油醚萃取,萃取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器于45±5 ℃減壓干燥,得到干燥原花青素初提物。

        1.3 分級處理試驗

        將1 g肉桂原花青素原料溶解在少量60%乙醇中,制得的濃溶液勻速加入吸附柱中,依次用20%、40%、60%、80%、100%乙醇溶液進(jìn)行梯度洗脫,分批收集不同百分比濃度乙醇的洗脫液。

        1.4 原花青素的回收率以及含量測定

        對各部分洗脫液于45±5 ℃溫度下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收溶劑,所得樣品分別標(biāo)為F20、F40、F60、F80、F100,在實驗室現(xiàn)有條件下利用香草醛-鹽酸法測定原花青素的含量,配制200 μg/ml的樣品甲醇溶液,取0.5 ml樣品加入10 ml比色管中后,依次加入3 ml濃度為4.0 g/100ml的香草醛-甲醇溶液,1.5 ml濃鹽酸,加塞搖勻,在20±1 ℃避光條件下反應(yīng)15 min后,于500 nm處測其吸光度,利用(+)-兒茶素作為標(biāo)準(zhǔn)品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線算出待測液質(zhì)量濃度,從而計算樣品純度[8]

        1.5 聚合度測定

        1.5.1 色譜分析條件。色譜柱為Agilent Analytical Eclipse XDB-C18柱(4.6 mm×150 mm ,0.5 μm);流動相為A:水(含TFA 0.1%),B:乙腈體系(含TFA 0.1%);梯度洗脫為0~40 min(4%~25% B)、40~45 min(25%~30% B)、45~55 min(30%~95% B)、55~65 min(95%~4% B);柱溫為30 ℃;流速為1.0 ml/min;進(jìn)樣量為10 μl;檢測波長為280 nm。

        1.5.2 (+)-兒茶素和(-)-表兒茶標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立。配制不同濃度的(+)-兒茶素溶劑溶液,過濾后進(jìn)行高效液相色譜分析,以(+)-兒茶素質(zhì)量或(-)-表兒茶素質(zhì)量為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線并擬合回歸方程。

        1.5.3 硫解目標(biāo)產(chǎn)物標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立。

        1.5.3.1 硫解反應(yīng)。

        1.5.3.1.1 樣品溶液配制。精確稱取部分樣品10 mg置于10 ml容量瓶,用 60%乙醇定容,得到濃度為1 mg/ml的樣品溶液。

        1.5.3.1.2 2-巰基乙醇反應(yīng)液的配置。分別精確量取2.5 ml 2-巰基乙醇、27.5 ml乙醇、16 ml蒸餾水、4 ml 4%鹽酸水溶液,充分混勻。

        1.5.3.1.3 硫解反應(yīng)。分別取100 μl樣品溶液、400 μl 2巰基乙醇反應(yīng)液于試管內(nèi),充分混勻,以100 μl 60%乙醇、400 μl 2-巰基乙醇反應(yīng)液為對照。于70 ℃恒溫水浴條件下反應(yīng)4 h,放置室溫冷卻。

        1.5.3.2 硫解產(chǎn)物的HPLC分析及產(chǎn)物的制備。利用硫解反應(yīng)液、 2巰基乙醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液、(+)-兒茶素、(-)-表兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行高效液相色譜分析,得到反應(yīng)產(chǎn)生的新化合物的波峰。將硫解反應(yīng)擴大,反應(yīng)后溶液經(jīng)大孔樹脂HP20吸附,用蒸餾水洗脫,除去剩余的2-巰基乙醇、鹽酸等,利用甲醇洗脫后溶液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)蒸干后既得到硫解產(chǎn)物。將樣品用少量蒸餾水溶解,上Sephadax柱,依次用400 ml 20%、40%、60%、80%甲醇洗脫,以薄層層析為指導(dǎo)合并洗脫液,再以高效液相色譜分析為指導(dǎo),找到目標(biāo)產(chǎn)物,將目標(biāo)產(chǎn)物干燥;然后將目標(biāo)產(chǎn)物用少量蒸餾水溶解上CG161M柱進(jìn)行純化,依次用200 ml 10%、30%、50%、70%、80%甲醇洗脫,以薄層層析為指導(dǎo)合并洗脫液,再以高效液相色譜分析為指導(dǎo),找到目標(biāo)產(chǎn)物,將目標(biāo)產(chǎn)物命名為2MEec[9]。

        1.5.3.3 建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。以制備的目標(biāo)產(chǎn)物為標(biāo)準(zhǔn)品,配制不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液,過濾后進(jìn)行高效液相色譜分析,以目標(biāo)產(chǎn)物為橫坐標(biāo),以峰面積為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線并擬合回歸方程。

        1.5.4 平均聚合度的計算方法。待測樣品按照“1.5.3.1”硫解反應(yīng)的方法處理以后,經(jīng)高效液相色譜分析檢測得到其相對應(yīng)的(+)-兒茶素、(-)-表兒茶素、2MEec的峰面積,再根據(jù)相對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得到相對應(yīng)的物質(zhì)的量,由公式mDP=計算出其平均聚合度。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 分級處理試驗結(jié)果

        2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立。以(+)-兒茶素為標(biāo)準(zhǔn)品所作的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示,擬合回歸線性方程為y=353.516 2x-14.230 8,相關(guān)系數(shù)R2=0.999 6,其中y為質(zhì)量濃度,μg/ml;x為吸光度。

        2.1.2 分級處理試驗中各部分純度及回收率。

        大孔吸附樹脂對肉桂原花青素進(jìn)行吸附,經(jīng)20%、40%、60%、80%、100%乙醇溶液依次進(jìn)行梯度洗脫,得到五部分樣品,標(biāo)記為F20、F40、F60、F80、F100,從表1可以看出,在五部分中總質(zhì)量最大的是F80部分,其總質(zhì)量為0.27 g,純度為74.81%;純度最高的是F40部分,其純度為82.65%,其總質(zhì)量為0.19 g;在五部分中總量以及純度最低的是F100部分,其總質(zhì)量為0.02 g,純度為65.11%,整個過程回收率為89%。

        3 結(jié)論與討論

        (1) 利用大孔吸附樹脂HP20分離肉桂原花青素,分離產(chǎn)生五部分樣品F20、F40、F60、F80、F100,總質(zhì)量最大的是F80部分,其總質(zhì)量為0.27 g,純度為74.81%;純度最高的是F40部分,其純度為82.65%,總質(zhì)量為0.19 g;在五部分中總量以及純度最低的是F100部分,其總質(zhì)量為0.02 g,純度為65.11%,整個過程回收率為89%。

        (2) 用不同濃度乙醇對吸附在HP20樹脂上的原花青素進(jìn)行梯度洗脫,洗脫液中原花青素的平均聚合度隨乙醇濃度的提高而升高,當(dāng)乙醇濃度<40%時洗脫液中原花青素的平均聚合度為2~5,可以認(rèn)為主要為低聚體;當(dāng)乙醇濃度>60%時,洗脫液中原花青素的平均聚合度為>5,可以認(rèn)為主要為原花青素高聚體。

        參考文獻(xiàn)

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