王淑敏 高永闖 李曉云

摘要 [目的] 研究“勿忘我”叢生芽誘導(dǎo)及植株再生。 [方法]以勿忘我為試材，取其莖尖、葉片和下胚軸為外植體，進(jìn)行叢生芽誘導(dǎo)試驗(yàn)。[結(jié)果]用莖尖作外植體產(chǎn)生叢生芽數(shù)量最多；以MS + 6BA 1.0 mg/L+NAA0.2 mg/L誘導(dǎo)成苗率最高，芽苗健壯；生根階段以1/2MS+IBA0.2mg/L生根效果最好，生根率可達(dá)100%。[結(jié)論] 研究勿忘我叢生芽誘導(dǎo)及植株再生具有一定的實(shí)踐意義和應(yīng)用價(jià)值。

關(guān)鍵詞 勿忘我； 叢生芽； 再生植株

中圖分類號(hào) S188 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2014）31-10842-03

Study on Cluster Bud Induction and Plant Regeneration of Myosotis sylvatica

WANG Shumin ，GAO Yongchuang，LI Xiaoyun

（College of Life Science， Langfang Teachers University， Langfang， Hebei 065000 ）

Abstract [Objective] The aim was to study cluster bud induction and plant regeneration of Myosotis sylvatica.[Method]Using Myosotis sylvatica as test materials， cluster bud induction was carried out taking its stem tip， leaf and hypocotyl as explant . [Result] Cluster bud induction number was the largest using stem tip as explant. MS + 6BA 1.0 mg/L + NAA 0.2 mg/L induction rate was highest，and bud seedling was strong； 1/2 ms + IBA0.2 mg/L rooting effect was best in rooting stage， and rooting rate could reach 100%. [Conclusion] Studying cluster bud induction and plant regeneration of Myosotis sylvatica had certain practical.

Key words Myosotis sylvatica； Cluster bud； Plant regeneration

勿忘我（Limonium sinuatum（L）.Mill）屬藍(lán)雪科（Plumbaginaceae）補(bǔ)血草屬（Limonium）多年生或二年生草本植物，原產(chǎn)地中海沿岸地區(qū)，株高可達(dá)1.1 m，花色繁多，具有天然干花的特性，花瓣含水量低，富有蠟質(zhì)，在植株體上呈現(xiàn)出干燥的蠟質(zhì)或紙質(zhì)的特色，可以長(zhǎng)期保持美麗的花色和花型，是目前天然干花類中作切花批量生產(chǎn)的花之一^[1]，也可在野生園林中作露地栽培，或剪下作小插花中主花的配花^[2]。藥理研究表明，勿忘我花茶含有豐富的維生素C，可延緩細(xì)胞衰老，提高機(jī)體免疫能力，抗病毒，抗癌防癌并能美白肌膚，具有護(hù)膚養(yǎng)顏、補(bǔ)腎提神、健胃開胃、調(diào)節(jié)血脂減肥、促進(jìn)新陳代謝等功能^[3]。

補(bǔ)血草屬植物具有大量的不孕枝和同型雜交不孕的特性，種子結(jié)實(shí)少，若用種子繁殖，種子來源的可靠性限制了批量生產(chǎn)^[2]。因此研究勿忘我叢生芽誘導(dǎo)及植株再生具有一定的實(shí)踐意義和應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及處理

1.1.1 試驗(yàn)材料。

選取飽滿無蟲害的勿忘我種子。

1.1.2 消毒方法。

將勿忘我種子，用無菌水沖洗3次，再用75%乙醇消毒30～40 s，無菌水沖洗5次，分別用0.1%升汞、2%次氯酸鈉消毒處理，具體為：

①0.1%升汞5 min；②0.1%升汞7 min；③0.1%升汞9 min；④2%次氯酸鈉8 min；⑤2%次氯酸鈉13 min；⑥2%次氯酸鈉18 min。

每次處理完用無菌水沖洗8～10次，每次1 min。然后將無菌種子種植在放有濾紙的無菌瓶和MS固體培養(yǎng)基中，置恒溫培養(yǎng)室中23 ℃培養(yǎng)，待發(fā)育成無菌苗。15 d后統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率、污染率。

發(fā)芽率=（發(fā)芽種子數(shù)/接種種子數(shù)）×100%

污染率=（污染種子數(shù)/接種種子數(shù)）×100%

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基。

A1：MS+6BA 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L；

A2：MS+6BA 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L；

A3：MS+6BA 1.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L。

1.2.2 生根培養(yǎng)基。

B0：1/2 MS；

B1：1/2 MS + IBA 0.2 mg/L；

B2：1/2 MS + IBA 0.4 mg/L；

B3：1/2 MS + IBA 0.6 mg/L。

1.3 叢生芽誘導(dǎo)

分別取勿忘我的下胚軸（長(zhǎng)0.5 cm）、莖尖（長(zhǎng)1 cm）、子葉（0.5 cm×0.5 cm）作為外植體，3種外植體均接種到A1 、A2、A3培養(yǎng)基上，在各培養(yǎng)基上接種30個(gè)，接種后在24 ℃下培養(yǎng)進(jìn)行叢生芽誘導(dǎo)^[4-6]。

1.4 生根與植株再生

剪取健壯的單芽（長(zhǎng)1.5～2.0 cm），分別接種到B0 、B1、 B2、B3培養(yǎng)基上進(jìn)行生根。

2 結(jié)果與分析

2.1 種子消毒結(jié)果

不同材料所用消毒液不同，消毒效果也不同。對(duì)于勿忘我種子而言，消毒效果最好的是升汞，但處理時(shí)間過長(zhǎng)易把種子殺死。首先取空白對(duì)照組，不加處理的勿忘我種子的發(fā)芽率為69%，污染率為71%。由表1可知，0.1%的升汞和2%的次氯酸鈉對(duì)勿忘我種子的消毒效果都很好，沒有污染，并在特定的消毒時(shí)間段內(nèi)，對(duì)種子的活性影響也較小。由此可知，使用次氯酸鈉對(duì)忽忘我種子消毒更適宜，尤以消毒8 min為宜，處理后對(duì)種子萌發(fā)率影響不大。勿忘我種子在接種15 d后即可長(zhǎng)成綠色健壯的無菌苗。

2.2 不同外植體對(duì)不定芽形成的影響

以莖尖為外植體，在基部膨大形成球狀愈傷組織，隨后產(chǎn)生大量叢生芽，速度最快的接種20 d后即有芽點(diǎn)形成；以莖段為外植體，莖段整體膨大，未產(chǎn)生叢生芽；以子葉為外植體，未形成芽。不同外植體對(duì)不定芽誘導(dǎo)效果影響很大，出芽情況以莖尖出芽率最高，而莖段和子葉則不能誘導(dǎo)出叢生芽。

2.3 不同濃度的6BA對(duì)莖尖叢生芽誘導(dǎo)的影響

接種后莖尖在下端邊緣開始膨大增厚，繼而周圍出現(xiàn)淺綠色顆粒狀突起，約25 d后，這些突起繼續(xù)生長(zhǎng)成淡綠色小芽。由表2可知，莖尖叢生芽發(fā)生數(shù)量隨6BA濃度的升高而增多。從生長(zhǎng)狀態(tài)來看，A3培養(yǎng)基所誘導(dǎo)的芽雖然在所有培養(yǎng)基中的芽數(shù)最多，但其芽的質(zhì)量較其他培養(yǎng)基而言不高（圖2），表明雖然6BA打破了其頂端優(yōu)勢(shì)，但其各個(gè)叢生芽的生長(zhǎng)點(diǎn)不突出，芽的健壯程度也較低。綜合來看，A2培養(yǎng)基上的芽生長(zhǎng)最好，出芽率適中，芽也健壯（圖1）。故在莖尖叢生芽的誘導(dǎo)中，6BA的濃度以1.0 mg/L為宜。

2.4 不同濃度的6BA對(duì)子葉叢生芽誘導(dǎo)的影響

子葉作為外植體接種到培養(yǎng)基上后無變化，隨著時(shí)間的推移子葉出現(xiàn)不同程度的褐化。在A1、A2和A3培養(yǎng)基中，子葉均沒有誘導(dǎo)出叢生芽，最后褐化干枯死亡。

2.5 不同濃度的6BA對(duì)莖段叢生芽誘導(dǎo)的影響

莖段作為外植體在叢生芽誘導(dǎo)過程中，膨大，但沒有產(chǎn)生愈傷組織，隨著時(shí)間的推移膨大的莖段褐化而死，最終沒有叢生芽的誘導(dǎo)；這可能是因?yàn)楫a(chǎn)生了大量次級(jí)代謝物，這些次級(jí)代謝物最后導(dǎo)致莖段死亡，沒有誘導(dǎo)出叢生芽。莖段叢生芽的誘導(dǎo)率也為0。

2.6 誘導(dǎo)芽苗生根效果

生根誘導(dǎo)以1/2MS為基本培養(yǎng)基，附加IBA，設(shè)計(jì)4個(gè)濃度水平。將繼代培養(yǎng)后高度達(dá)1.5～2.0 cm，生長(zhǎng)健壯的芽苗進(jìn)行生根誘導(dǎo)。無根苗在生根培養(yǎng)基中，約9 d后分化形成根。

3 討論

3.1 外植體消毒

從外界取得的外植體進(jìn)行接種時(shí)，常含有較多的雜菌，對(duì)其消毒時(shí)間太短不易除去，時(shí)間太長(zhǎng)又會(huì)對(duì)外植體造成較大的傷害。該試驗(yàn)選取種子進(jìn)行消毒較容易，基本解決了上述問題，污染率降低，適合選用。在試驗(yàn)中采用2種方式進(jìn)行消毒，最終結(jié)果都很好，沒有出現(xiàn)污染，而且在種子萌發(fā)率上差別也不大。綜合簡(jiǎn)單易行的原則和環(huán)境友好性原則，推薦使用次氯酸鈉作為消毒劑，處理時(shí)間以8 min為宜。

3.2 外植體選擇

該試驗(yàn)選取莖尖、莖段（不帶腋芽）、子葉作外植體，通過誘導(dǎo)，3種外植體都可誘導(dǎo)出愈傷。但莖段和子葉不能誘導(dǎo)出叢生芽，莖段膨大出現(xiàn)愈傷后再培養(yǎng)則會(huì)褐化死亡。莖尖作為外植體誘導(dǎo)速度最快，芽苗健壯，增殖率高，是勿忘我進(jìn)行離體快速繁殖的最佳外植體。

3.3 最佳叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基

馮曉英在對(duì)6芐氨基嘌呤（6BA）、激動(dòng)素（KT）和苯基噻二唑脲（TDZ）在勿忘我芽增殖上的效果進(jìn)行了比較。苯基噻二唑脲（TDZ）是一種具有高度細(xì)胞分裂素活性的棉花脫葉劑，當(dāng)TDZ濃度為0.01 mg/L時(shí)，勿忘我離體培養(yǎng)芽增殖的能力相當(dāng)于6BA 0.4 mg/L時(shí)的增殖能力。當(dāng)TDZ濃度為0.04和0.06 mg/L時(shí)，芽的增殖效果與不加任何試劑差異不大。

3.4 最佳生根培養(yǎng)基

觀察發(fā)現(xiàn)，NAA誘導(dǎo)生根，根基部愈傷組織較少，根粗壯，數(shù)量多，且有一定的長(zhǎng)度；IBA則根少細(xì)長(zhǎng)。結(jié)果表明，試管苗生根以0.4 mg/L NAA效果較好，其次是0.6 mg/L NAA和0.2 mg/L IBA。在植物試管苗微型繁殖誘導(dǎo)生根階段，由于培養(yǎng)環(huán)境的高溫、高濕和弱光等因素的影響，常使得芽苗徒長(zhǎng)和根系纖弱，導(dǎo)致再生小植株的抗逆性差和移栽成活率低。這表明，低濃度的PP333對(duì)根的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，生根率與對(duì)照組只加 0.4 mg/L NAA 差異不大，但可以使根加粗，而高濃度時(shí)所需根長(zhǎng)時(shí)間明顯縮短，生根率降低，根特粗。從苗長(zhǎng)勢(shì)來看，以在生根培養(yǎng)基中附加0.02%PP333的長(zhǎng)勢(shì)為好。

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