王宜磊 朱陶 孟國慶 張海麗 袁琴琴 王傳寶 諶志偉

摘要 [目的]研究優(yōu)化啤酒酵母海藻糖提取工藝。[方法] 以啤酒廢酵母為原料，使用各種不同的方法（微波破壁法、高溫處理破壁、煮沸提取法）提取海藻糖，以海藻糖得率以及工藝的效益性為指標(biāo)考察料液比、浸提時間、浸提溫度、輔助因素處理等單因素對海藻糖提取的影響，從而確定從廢酵母中提取海藻糖的較佳工藝。[結(jié)果] 試驗得出，微波破碎法耗時少，但不易工業(yè)化且提取率不高，比較發(fā)現(xiàn)煮沸提取的工藝方法相對最佳。以水作提取劑從廢酵母中提取海藻糖的最佳條件是：煮沸80 min，海藻糖提取率為8.147 mg/g干酵母。[結(jié)論]研究可為海藻糖的提取及進一步開發(fā)利用提供參考。

關(guān)鍵詞 啤酒廢酵母;海藻糖; 蒽銅-濃硫酸比色法; 3，5-二硝基水楊酸比色法

中圖分類號 S609.9 文獻標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2014）33-11884-04

Study on Beer Yeast Trehalose Extraction Technology

WANG Yi-lei， ZHU Tao， MENG Guo-qing et al

（Department of Life Science， Heze University， Heze， Shandong 274015）

Abstract [Objective] To optimize the technique for extracting trehalose from beer yeast. [Method] Using beer waste yeast as material， various methods（microwave， high temperature， boiling）were adopted to extract trehalose. With trehalose yield and the benefits of technology as indicators， effects of solid-liquid ratio， soaking time， temperature， auxiliary factors on trehalose extraction were investigated， the optimal technique was obtained. [Result] Comparison found that boiling extraction technology is the best relatively. The extraction rate of trehalose was 8.147 mg /g dry yeast cells under the optimum technical conditions with boiling 80 min. [Conclusion] The study can provide reference for trehalose extraction and further utilization.

Key words Waste beer yeast; Trehalose; Anthracene copper-sulfuric acid colorimetry; 3，5-two nitro salicylic acid colorimetry

基金項目 山東省科技計劃資助項目（2011GSF2114）;菏澤市科技計劃項目（2010S002）。

作者簡介 王宜磊（1964-），男，山東巨野人，教授，從事微生物生理學(xué)方面研究。

收稿日期 2014-10-15

海藻糖（Trehalose）是一種由2個葡萄糖分子通過半縮醛羥基以α-1，1糖苷鍵結(jié)合的非還原性雙糖[1]。有“21世紀(jì)生命之糖”稱號的海藻糖具有非特異性的保護功能，引起了全球科研人員的研究熱潮[2-3]。它不僅可作為生物體內(nèi)的能量儲備，也具有在干燥條件下保護核酸、蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)不受侵害的功能，更值得關(guān)注的是，外源性的海藻糖同樣也可以保護細(xì)胞和生命大分子[4]，對蛋白質(zhì)變性具有保水作用和保護作用[5]。海藻糖的這些特性決定了它在疫苗、菌苗、食品、醫(yī)藥衛(wèi)生、化妝品等領(lǐng)域的生產(chǎn)中有著廣闊的應(yīng)用前景。

海藻糖最初是Wiggers從黑麥的麥角中首次分離出來的，后來發(fā)現(xiàn)在其他真菌、細(xì)菌、昆蟲血、地衣、酵母以及無脊椎動物中亦有廣泛存在[6]。特別是在酵母中含量豐富[7]， 且由于酵母容易培養(yǎng)、生長快速，目前世界各國產(chǎn)海藻糖的主要方法是從酵母菌中提取。目前海藻糖的生產(chǎn)主要存在的問題是海藻糖資源不夠和生產(chǎn)費用太高。隨著生產(chǎn)技術(shù)與工藝的改進與提高，它將更加廣泛地用于食品、醫(yī)藥等多個領(lǐng)域內(nèi)。從酵母細(xì)胞內(nèi)提取海藻糖，大都采用乙醇回流提取工藝。但是該傳統(tǒng)方法大多表現(xiàn)為提取時間太長、海藻糖收率很低、雜質(zhì)溶出過多等諸多問題。隨著人們對其破壁提取技術(shù)的進一步研究與探索和我國科技的快速發(fā)展，通過不同方法如：反復(fù)凍融法破壁、高壓脈沖電場破壁、微珠渦流發(fā)破壁、雙螺桿擠壓膨化法破壁、酶法等大大改善了傳統(tǒng)的方法，提高了破壁率、海藻糖提取率。

在查閱大量文獻的基礎(chǔ)上，筆者以啤酒廢酵母為原料，使用各種不同的方法（微波破壁法、高溫處理破壁、煮沸提取法）提取海藻糖，然后以海藻糖得率以及工藝的效益性來確定從廢酵母中提取海藻糖的較佳工藝。分別用微波破壁啤酒酵母提取海藻糖、對啤酒酵母高溫處理破壁提取海藻糖，煮沸啤酒酵母提取海藻糖，然后比較這3種方法中的各因素對海藻糖提取率的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1

原料。啤酒廢酵母：由青島啤酒廠提供。該試驗經(jīng)預(yù)處理獲得的廢酵母每100 g濕酵母可獲得25.4 g干酵母。

1.1.2

主要儀器。電子分析天平（型號FA1604），上海天平儀器廠;微波爐（型號EM-183SM1），合肥容事達三洋電器股份有限公司;臺式低速離心機（型號TDL-5-A），上海安亭儀器廠;分光光度計（型號7230G），北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;三用電熱恒溫水箱（型號S·HH·WZ1-Cr），北京長安科學(xué)儀器廠。

1.1.3

主要試劑與配制方法。氯仿∶正丁醇試劑：氯仿∶正丁醇=5∶1配制。蒽酮-濃硫酸試劑：200 mg蒽酮，100 ml濃硫酸配制而成的，一定邊加邊攪拌，得到黃色透明溶液體，將其置于棕色瓶中，要求現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2 方法

1.2.1

檢測方法。海藻糖得率以提取液中海藻糖的含量作為指標(biāo)。配制海藻糖標(biāo)準(zhǔn)液，按照蒽酮-濃硫酸比色法測定其吸光度，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。

1.2.2

海藻糖提取率的計算公式。公式如下：

海藻糖的提取率（%）=[（海藻糖濃度（g/L）×總體積（L）×稀釋倍數(shù)）/干酵母質(zhì)量（g）]×100

1.2.3

廢酵母的預(yù)處理。

因為啤酒生產(chǎn)末期排放出來的廢液中除了酵母，還有大量的麥殼、碎米渣、酒花沉淀物等雜質(zhì)，這些都不利于提取，所以要先洗滌除雜、得到純凈的啤酒廢酵母。其工藝流程如下：啤酒廢酵母→加蒸餾水稀釋→100分樣篩篩分一次→3 000 r/min離心分離→純凈的啤酒廢酵母。

1.2.4

海藻糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。配制100 mg/L的海藻糖標(biāo)準(zhǔn)液，取6支試管，按表1分別加入100 mg/L的海藻糖標(biāo)準(zhǔn)液、蒸餾水、蒽酮-濃硫酸試劑。

表1 海藻糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

加入蒽酮-濃硫酸試劑之后，一起浸沸水浴中加熱5 min。煮完取出，用自來水沖冷，然后在分光光度計上進行比色。調(diào)整波長為590 nm，用1號管調(diào)零點，測出1～6號管的OD值。以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，海藻糖濃度為橫坐標(biāo)，做出標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5

微波處理。

不同處理時間：定量稱取廢濕酵母5份，每份0.1 g置于50 ml燒杯中，并均勻地鋪在燒杯底部，然后置微波爐內(nèi)能量分布均勻的位置，800 W功率分別處理90、120、180、240、300 s。然后分別加入10 ml的蒸餾水，讓酵母充分溶解后靜置10 min，用移液槍分別取上清液3.3 ml于5支試管內(nèi)，再向試管里分別加入0.66 ml的Sevage試劑（氯仿∶正丁醇=5∶1），充分振蕩后，以3 000 r/min離心10 min，然后分別取離心管內(nèi)的上清液2.00 ml于5支試管內(nèi)，再取1支試管加入2.00 ml蒸餾水（空白對照），再往6支試管內(nèi)分別加入8.00 ml的蒽酮-濃硫酸試劑，放置沸水中加熱5 min，然后用自來水沖冷，然后在分光光度計上進行比色，調(diào)整波長為590 nm，用空白對照試管調(diào)零，測出1～5號管的OD值。通過海藻糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出各自的海藻糖濃度。

不同料液比處理：定量稱取廢濕酵母5份，每份0.1 g置于50 ml燒杯中，并均勻地鋪在燒杯底部，然后置微波爐內(nèi)能量分布均勻的位置，800 W功率處理180 s，然后分別加入8、10、12、14 ml的蒸餾水，讓酵母充分溶解后靜置10 min，用移液槍分別取上清液3.3 ml于5支試管內(nèi)，再向試管里分別加入0.66 ml的Sevage試劑（氯仿∶正丁醇=5∶1），充分振蕩后，以3 000 r/min離心10 min，然后分別取離心管內(nèi)的上清液2.00 ml于5支試管內(nèi)，再取1支試管加入2.00 ml蒸餾水（空白對照），再往6支試管內(nèi)分別加入8.00 ml的蒽酮-濃硫酸試劑，放置沸水中加熱5 min，然后用自來水沖冷，然后在分光光度計上進行比色，調(diào)整波長為590 nm，用空白對照試管調(diào)零，測出1～5號管的OD值。通過海藻糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出各自的海藻糖濃度。

1.2.6

高溫處理。

不同處理時間：量取廢濕酵母5份，每份0.1 g置于50 ml燒杯中，并均勻地鋪在燒杯底部，然后放在80 ℃的恒水浴中分別處理20、30、40、50、60 min。然后分別加入10 ml的蒸餾水，讓酵母充分溶解后靜置10 min，用移液槍分別取上清液3.3 ml于5支試管內(nèi)，再向試管里分別加入0.66 ml的Sevage試劑（氯仿∶正丁醇=5∶1），充分振蕩后，以3 000 r/min離心10 min，然后分別取離心管內(nèi)的上清液2.00 ml于5支試管內(nèi)，再取1支試管加入2.00 ml蒸餾水（空白對照），再往6支試管內(nèi)分別加入8.00 ml的蒽酮-濃硫酸試劑，放置沸水中加熱5 min，然后用自來水沖冷，然后在分光光度計上進行比色，調(diào)整波長為590 nm，用空白對照試管調(diào)零，測出1～5號管的OD值。通過海藻糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出各自的海藻糖濃度。

不同處理溫度：量取廢濕酵母5份，每份0.1 g置于50 ml燒杯中，并均勻地鋪在燒杯底部，然后分別放進先前調(diào)好的5個恒溫水浴鍋中，恒溫水浴鍋溫度分別為60、70、80、90、100 ℃。處理40 min后，分別向5 個燒杯中加入10 ml的蒸餾水，讓酵母充分溶解后靜置10 min，用移液槍分別取上清液3.3 ml于5支試管內(nèi)，再向試管里分別加入0.66 ml的Sevage試劑（氯仿∶正丁醇=5∶1），充分振蕩后，以3 000 r/min離心10 min，然后分別取離心管內(nèi)的上清液2.00 ml于5支試管內(nèi)，再取1支試管加入2.00 ml蒸餾水（空白對照），再往6支試管內(nèi)分別加入8.00 ml的蒽酮-濃硫酸試劑，放置沸水中加熱5 min，然后用自來水沖冷，然后在分光光度計上進行比色，調(diào)整波長為590 nm，用空白對照試管調(diào)零，測出1～5號管的OD值。通過海藻糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出各自的海藻糖濃度。

不同料液比處理：量取廢濕酵母5份，每份0.1 g置于50 ml燒杯中，并均勻地鋪在燒杯底部，然后在80 ℃的恒溫水浴鍋中處理40 min，處理后分別向5個燒杯中加入8、9、10、11、12 ml的蒸餾水，讓酵母充分溶解后靜置10 min，用移液槍分別取上清液3.3 ml于5支試管內(nèi)，再向試管里分別加入0.66 ml的Sevage試劑（氯仿∶正丁醇=5∶1），充分振蕩后，以3 000 r/min離心10 min，然后分別取離心管內(nèi)的上清液2.00 ml于5支試管內(nèi)，再取1支試管加入2.00 ml蒸餾水（空白對照），再往6支試管內(nèi)分別加入8.00 ml的蒽酮-濃硫酸試劑，放置沸水中加熱5 min，然后用自來水沖冷，然后在分光光度計上進行比色，調(diào)整波長為590 nm，用空白對照試管調(diào)零，測出1～5號管的OD值。通過海藻糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出各自的海藻糖濃度。

1.2.7

沸水處理。稱取廢濕酵母5份，每份0.1 g置于50 ml燒杯中，并均勻地鋪在燒杯底部，加一定量的蒸餾水混合，用電鍋煮沸，此過程會有大量的水蒸出， 要不斷補加水，每10 min補加相同的水分，提取過程要注意不斷攪拌。從沸騰開始計時，每經(jīng)過20 min停止對一只燒杯煮沸。這樣對5支燒杯分別處理了20、40、60、80、100 min。然后靜置10 min，用移液槍分別取上清液3.3 ml于5支試管內(nèi)，再向試管里分別加入0.66 ml的Sevage試劑（氯仿∶正丁醇=5∶1），充分振蕩后，以3 000 r/min離心10 min，然后分別取離心管內(nèi)的上清液2.00 ml于5支試管內(nèi)，再取1支試管加入2.00 ml蒸餾水（空白對照），再往6支試管內(nèi)分別加入8.00 ml的蒽酮-濃硫酸試劑，放置沸水中加熱5 min，然后用自來水沖冷，然后在分光光度計上進行比色，調(diào)整波長為590 nm，用空白對照試管調(diào)零，測出1～5號管的OD值。通過海藻糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出各自的海藻糖濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 海藻糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線與方程

如圖1得到的直線方程為y=0.012 7x+0.001 2，相關(guān)系數(shù)為0.999 1，表明海藻糖濃度在0～75 mg/ml的范圍內(nèi)與吸光度呈正相關(guān)，方程中的y為吸光度，x為海藻糖的質(zhì)量濃度。

圖1 海藻糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 微波處理啤酒酵母的情況下海藻糖的提取率

微波破碎啤酒酵母細(xì)胞是由于胞內(nèi)物質(zhì)局部受熱、內(nèi)壓快速升高而使細(xì)胞發(fā)生破碎的。微波具有穿透力強、升溫快的特點，通過微波處理后，酵母細(xì)胞不僅實現(xiàn)了細(xì)胞破碎，胞內(nèi)海藻糖酶活性也會快速喪失活性[8]。該試驗通過考慮微波處理的時間不同、料液比不同得到的海藻糖提取率的變化情況如圖2、3所示。

圖2 微波時間對海藻糖提取率的影響

圖3 微波處理下料液比對海藻糖提取率的影響

由圖2、3可知，微波處理可在比較短的時間里滅活海藻糖酶和對細(xì)胞的破壁，大大方便了細(xì)胞內(nèi)海藻糖的提取。在微波處理時間和料液比這2個影響因素中，微波處理不但滅活了海藻糖酶，還破壞了酵母細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，大大減小了提取阻力。因此，綜合考慮各種因素的影響，確定采用微波預(yù)處理方法提取海藻糖的最佳條件是：微波作用180 s，料液比1∶100 g/ml下用水為提取液提取，海藻糖提取率為4.985 mg/g干酵母。

2.3 高溫處理啤酒酵母的情況下海藻糖的提取率

高溫可使海藻糖酶變性失活，高溫干燥還可使酵母細(xì)胞壁受到嚴(yán)重?fù)p壞，使其表面形成許多的裂縫，從而使酵母細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)容易流出來[9]。因此可以采用高溫破碎廢酵母細(xì)胞達到提取海藻糖的目的。該試驗通過考慮高溫處理的時間不同、溫度不同、料液比不同得到的海藻糖提取率變化情況如圖4～6所示。

圖4 高溫處理不同時間對海藻糖提取率的影響

圖5 高溫處理不同溫度對海藻糖提取率的影響

圖6 高溫處理不同的料液比對海藻糖的提取率的影響

由圖4、5、6可知，高溫處理溫度和處理時間對海藻糖提取率影響較大。綜合考慮各影響因素以及考慮到經(jīng)濟因素得到的高溫預(yù)處理方法的最佳條件為：90 ℃烘箱中處理40 min，料液比為1∶100 g/ml，此時的海藻糖最大得率為7.992 mg/g干酵母。

2.4 沸水處理啤酒酵母的情況下海藻糖的提取率

煮沸提取可做到滅活海藻糖酶、破碎細(xì)胞以及提取同時進行[10]。經(jīng)過煮沸處理時間不同后得到的海藻糖提取率變化情況如圖7所示。

圖7 沸水浴處理不同時間對海藻糖提取率的影響

圖7可以看出，在80 min內(nèi)，隨著時間的增加，海藻糖的提取率大幅增加，但繼續(xù)增加處理時間，海藻糖的提取率增幅趨于平穩(wěn)，考慮綜合因素，確定以水作提取劑從廢酵母中提取海藻糖的最佳條件是：煮沸80 min，海藻糖提取率為8.147 mg/g。

2.5 廢酵母不同處理方法提取海藻糖的比較

[11-12] 由表2可見，微波破碎法雖然用時較少，但不容易工業(yè)化使用且提取率不高。高溫處理廢酵母， 如高溫干燥和煮沸提取，得到的海藻糖提取率較高，分別為 7.992 mg/g干酵母和8.147 mg/g干酵母。而且這2種方法使酵母細(xì)胞內(nèi)的海藻糖酶容易失活同時也使啤酒酵母細(xì)胞內(nèi)的海藻糖變得容易提取。其原因可能是以下2點：一是高溫（熱）處理時，酵母從室溫升到高溫使其死亡的溫度之前，由于受到高溫的傷害，細(xì)胞內(nèi)海藻糖的含量增加;二是高溫作用使酵母細(xì)胞內(nèi)的海藻糖酶完全失活，使海藻糖不被降解，使其容易提取。高溫干燥和沸水處理雖然都能有效提高海藻糖的提取率，但是在試驗過程中可以發(fā)現(xiàn)高溫干燥處理的一些缺點。一是高溫干燥要除去酵母中的水分，能耗大，不經(jīng)濟環(huán)保; 二是酵母干燥后往往使酵母硬結(jié)成塊，提取前需要將其粉碎，造成了提取工藝的不必要的復(fù)雜與不便。而煮沸提取可做到滅活海藻糖酶、破碎細(xì)胞以及提取同時進行，簡化了提取工藝，提高了海藻糖提取率。所以該試驗確定水為提取劑、采用煮沸提取的方法作為最佳提取工藝。

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié)論

該試驗以水作提取劑從廢酵母中提取海藻糖，考察了用微波破碎細(xì)胞后提取、高溫處理后提取、煮沸后提取3種方法，結(jié)果得出，微波破碎法耗時少，但不易工業(yè)化且提取率不高，比較發(fā)現(xiàn)煮沸提取的工藝方法相對最佳。以水作提取劑從廢酵母中提取海藻糖的最佳條件是：煮沸80 min，海藻糖提取率為8.147 mg/g干酵母。

表2 不同處理方法的比較

3.2 討論

通過查閱文獻獲知，用水作提取劑和用乙醇作提取劑的提取率相差不大，而且水提取的溫度高于乙醇水溶液提取，但提取時間比乙醇水溶液短，考慮到乙醇的成本比水的成本高，回收比較麻煩。所以，對工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)，選擇水提取方法來制備海藻糖比較適宜。

酵母細(xì)胞內(nèi)海藻糖的提取必須抑制海藻糖酶的活性，該試驗設(shè)計的3種方法都能有效抑制海藻糖酶的活性，例如微波具有穿透力強、升溫快的特點，通過微波處理可迅速使海藻糖酶喪失活性。海藻糖酶在微波場中失活很快，經(jīng)短時間微波處理后，酵母細(xì)胞不僅破碎了，而且胞內(nèi)海藻糖酶活性也已完全喪失。微波破細(xì)胞與高壓勻漿、珠磨等細(xì)胞破碎方法最大的區(qū)別在于，微波破碎細(xì)胞是基于胞內(nèi)物質(zhì)局部受熱、內(nèi)壓升高而使細(xì)胞發(fā)生破碎的，微波破壁只使細(xì)胞表面出現(xiàn)孔洞和裂紋，小分子物質(zhì)可以自由進出細(xì)胞，但并未將細(xì)胞內(nèi)容物完全釋放到胞外，細(xì)胞仍保持其形態(tài)，雜質(zhì)溶出少，為后面的提取工作提供方便。高溫處理和沸水處理都利用了酶的性質(zhì)，高溫使海藻糖酶活性喪失，而且同時由于酵母細(xì)胞受高溫影響使其細(xì)胞壁破裂，從而使海藻糖容易流出，易于提取。再者，該試驗采用的是物理方法，相比于其他化學(xué)或者生物方法處理酵母，從根本上減少了對化學(xué)試劑的使用，減少了環(huán)境的污染，更加經(jīng)濟、高效、環(huán)保。另外，物理法破壁還有很多種，如反復(fù)凍融法、超聲波破壁法等，該試驗沒有用反復(fù)凍融法，是因為該方法工藝相對復(fù)雜，耗時長，難以工業(yè)化生產(chǎn)。

從試驗結(jié)果可以看出，海藻糖的提取率不是很高，可能的原因：一是該試驗所用的啤酒廢酵母放置時間過長，其體內(nèi)的海藻糖酶分解了一部分海藻糖;二是在試驗過程中經(jīng)過微波處理或高溫處理后，酵母過于干燥凝結(jié)成塊，對其溶解時不完全，造成少部分的海藻糖丟失。以后如果再次研究該方面的課題以考慮在破壁處理時添加一些輔助工作，如在物理場輔助下進行或者添加一些生物酶。在輔助條件下用這3種方法（微波處理、高溫處理、沸水處理）處理酵母，應(yīng)該破壁效果更佳，海藻糖提取率更高，更加利于工業(yè)化大生產(chǎn)。

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