張良等

摘要：為了優(yōu)化金針菇（Flammulina velutiper Sing）菌糠多糖的提取工藝，在單因素試驗的基礎上根據Box-Behnken中心組合試驗設計原理對提取時間、水料比、提取溫度進行三因素三水平的試驗設計，采用響應面軟件Design-Expert進行處理，得到金針菇菌糠多糖的最佳提取條件為：提取溫度95 ℃，水料比15∶1，提取4.26 h，此條件下提取的多糖含量為13.704 mg/mL，與預測值13.320 mg/mL十分接近，表明該模型可行。

關鍵詞：金針菇（Flammulina velutiper Sing）；菌糠；多糖；響應面分析法

中圖分類號：Q53；S646.1+5 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）16-3886-04

Abstract： Single-factor experiments and Box-Behnken central composite design were used to optimize the extraction of polysaccharides from waste materials of mushroom. The three factors and three levels including the extraction time， water-material ratio， extraction temperature of the experiment were designed. Response surface processing Design-Expert software was used. Results showed that optimal extraction conditions were temperature of 95 ℃， water-material ratio 15：1， time of 4.26 h. This condition could obtain 13.704 mg/mL polysaccharide， close to the predicting result of 13.320 mg/mL， proving that the model was feasible.

Key words：mushroom； waste material； polysaccharide； response surface analysis method

金針菇（Flammulina velutiper Sing）屬傘菌目白蘑科金針菇屬， 其味道清新淡雅，營養(yǎng)豐富，是拌涼菜和火鍋的上好食材。從金針菇中提取的多糖具有增強淋巴細胞免疫活性[1]的作用，可以抗腫瘤、抗白血病[2]，并且在體外有較好的抗氧化活性[3]。經過化學修飾的金針菇多糖對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌具有抑菌活性[4]。除此之外，動物試驗說明對特定類型的記憶障礙，其治療效果與腦復新相當[5]。一些學者對真菌中提取的多糖做了大量研究，但是鮮見有從金針菇菌糠中提取多糖的報道[6-8]。

本試驗主要研究提取溫度、水料比和提取時間對金針菇多糖提取量的影響，并且應用響應面法對提取工藝參數進行了優(yōu)化，以獲得金針菇多糖提取的最佳條件，為大規(guī)模工業(yè)提取提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金針菇菌糠；葡萄糖、濃硫酸、苯酚，以上皆為分析純試劑。

1.2 儀器與設備

電熱鼓風干燥箱；分光光度計；水浴鍋；電子天平；高速離心機。

1.3 試驗方法

1.3.1 原料預處理 將圓柱狀的金針菇菌糠掰碎至花生大小，然后放入鼓風干燥箱中，在60 ℃的條件下烘干至恒重。粉碎，過20目篩存放至干燥處備用。

1.3.2 金針菇多糖提取及檢測過程 菌糠→不同條件下浸提→離心后取上清液→上清液稀釋20倍后取1 mL→加入0.5 mL 6%的苯酚試劑和2.5 mL的濃硫酸試劑→搖勻→靜置20 min→在490 nm的波長處測吸光度。

1.3.3 標準曲線的制作 準確稱取標準品葡萄糖20 mg于500 mL容量瓶中，加水至刻度，分別吸取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL，以去離子水補至1.0 mL，然后加入6%苯酚0.5 mL及濃硫酸2.5 mL，搖勻冷卻，室溫放置20 min后于490 nm處測吸光度，以1.0 mL去離子水作為空白，橫坐標為葡萄糖濃度，縱坐標為吸光度，結果見圖1。

1.3.4 單因素試驗

1）提取時間。精確稱取10 g金針菇菌糠于250 mL錐形瓶中，加入200 mL去離子水，搖勻至菌糠全部濕潤，然后分別在95 ℃的條件下加熱1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 h，冷卻，于3 000 r/min的條件下離心5 min，取上清液，稀釋20倍后取1 mL，分別加入6%的苯酚0.5 mL及濃硫酸2.5 mL，搖勻冷卻，室溫放置20 min后在490 nm處測吸光度，對照標準曲線得多糖含量。

2）水料比。精確稱取5 g金針菇菌糠，分別按照10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1、45∶1的水料比（V/m，mL∶g，下同）加去離子水，搖勻至菌糠全部潤濕，95 ℃水浴4 h，測多糖含量。

3）提取溫度。精確稱取10 g金針菇菌糠于250 mL錐形瓶中，加入200 mL去離子水，搖勻至菌糠完全潤濕，然后分別在65、70、75、80、85、90、95 ℃條件下水浴4 h，測多糖含量。

1.3.5 正交試驗設計 根據Box-Behnken中心組合試驗設計原理，結合單因素試驗結果，分別選取對多糖提取量有顯著影響的溫度、水料比、時間， 應用三水平三因素的響應面分析方法進行試驗。因素與水平見表1。endprint

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 提取時間對多糖含量的影響 由圖2可知，開始時，隨著提取時間的延長，多糖的含量處于上升的趨勢，提取時間為3.5～4.0 h時，多糖含量達到最高。其后，隨著提取時間的增加，多糖含量由于水解作用反而降低，故提取時間選擇4.0 h。

2.1.2 水料比對多糖含量的影響 由圖3可知，隨著水比例的增加，多糖含量呈先升高后降低的趨勢，勢，在水料比為15∶1時多糖含量達到最高，故選擇水料比為15∶1。

2.1.3 提取溫度對多糖含量的影響 由圖4可知，隨著提取溫度的升高，提取液中的多糖含量不斷上升，當提取溫度升至85～95 ℃時，多糖含量上升幅度趨于平緩。但過高的溫度可以使水分蒸發(fā)過多，有可能使多糖水解導致含量下降，所以溫度不宜超過95 ℃。

2.2 響應面試驗結果

對金針菇多糖的提取工藝進行響應面分析，試驗方案和結果見表2。

2.2.1 各因素間的相互影響 采用相應軟件Design-Expert進行響應面處理。將表2的試驗結果輸入軟件后可以得到時間-水料比、時間-溫度、溫度-水料比的相互關系圖。

從圖2至圖4中可以看出，水料比是影響提取多糖含量的最大因素，時間和溫度對提取含量的的影響程度相近。

2.2.2 最佳條件確定 從Design-Expert軟件中可以得到回歸方程：R=118.625 20+26.671 02X1-1.356 82X2-3.374 60X3-0.082 830X1X2-0.036 813 X1X3-0.003 94X2X3-2.574 49X12+0.036 728X22+0.020 640X32，通過軟件求偏微分方程得到最佳條件為：提取時間4.26 h，溫度95 ℃，水料比15∶1。為驗證用響應面優(yōu)化后的最佳提取條件是否可靠，采用以上試驗條件進行提取，得到的產物中多糖含量為13.704 mg/mL，與預測值13.320 mg/mL十分接近，表明該模型可行。因此用響應面法優(yōu)化得到的最佳提取條件具有實用價值。

3 結論

通過對金針菇菌糠多糖提取溫度、水料比、時間三個條件的單因素試驗設計，并且針對這三個因素三水平的響應面進行分析，得到金針菇菌糠多糖的最佳提取工藝為：提取溫度95 ℃，提取時間4.26 h，提取水料比15∶1，此時多糖含量為13.704 mg/mL。

參考文獻：

[1] 王玉峰，王 旻，尹鴻萍.金針菇菌絲體中多糖的分離、結構鑒定及免疫學活性[J].中國天然藥物，2008，6（4）：312-315.

[2] 苗立成，王立強，吳 迪.金針菇多糖對小鼠抗腫瘤及抗白血病效應的實驗研究[J].解放軍藥學學報，2003，19（3）：171-173.

[3] 葉 敏.金針菇多糖的提取及清除羥自由基活性研究[J].畢節(jié)學院學報（綜合版），2011，29（4）：90-94.

[4] 劉 瑩，許 琳，趙 杰.金針菇多糖衍生物的制備及其抗菌性的測定[J].食品工業(yè)科技，2013，34（6）：137-139.

[5] 鄒 宇，廖森泰，吳娛明，等.金針菇多糖提取物對記憶障礙模型大鼠、小鼠學習記憶能力的影響[J].中國食品學報，2010（1）：26-30.

[6] 馬壽福，軍 花，刁治民，等.食用菌菌糠營養(yǎng)價值及利用途徑的研究[J].青海草業(yè)，2006，15（3）：36-40.

[7] 王永軍，田秀娥，李浩波.菌糠的營養(yǎng)價值與開發(fā)利用[J].中國飼料，2001（12）：30-31.

[8] 劉曉牧，王中華，李福昌，等.菌糠的營養(yǎng)價值及其應用飼料與畜牧[J].飼料與畜牧，2000，8（6）：12-13.

（責任編輯 龍小玲）endprint

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 提取時間對多糖含量的影響 由圖2可知，開始時，隨著提取時間的延長，多糖的含量處于上升的趨勢，提取時間為3.5～4.0 h時，多糖含量達到最高。其后，隨著提取時間的增加，多糖含量由于水解作用反而降低，故提取時間選擇4.0 h。

2.1.2 水料比對多糖含量的影響 由圖3可知，隨著水比例的增加，多糖含量呈先升高后降低的趨勢，勢，在水料比為15∶1時多糖含量達到最高，故選擇水料比為15∶1。

2.1.3 提取溫度對多糖含量的影響 由圖4可知，隨著提取溫度的升高，提取液中的多糖含量不斷上升，當提取溫度升至85～95 ℃時，多糖含量上升幅度趨于平緩。但過高的溫度可以使水分蒸發(fā)過多，有可能使多糖水解導致含量下降，所以溫度不宜超過95 ℃。

2.2 響應面試驗結果

對金針菇多糖的提取工藝進行響應面分析，試驗方案和結果見表2。

2.2.1 各因素間的相互影響 采用相應軟件Design-Expert進行響應面處理。將表2的試驗結果輸入軟件后可以得到時間-水料比、時間-溫度、溫度-水料比的相互關系圖。

從圖2至圖4中可以看出，水料比是影響提取多糖含量的最大因素，時間和溫度對提取含量的的影響程度相近。

2.2.2 最佳條件確定 從Design-Expert軟件中可以得到回歸方程：R=118.625 20+26.671 02X1-1.356 82X2-3.374 60X3-0.082 830X1X2-0.036 813 X1X3-0.003 94X2X3-2.574 49X12+0.036 728X22+0.020 640X32，通過軟件求偏微分方程得到最佳條件為：提取時間4.26 h，溫度95 ℃，水料比15∶1。為驗證用響應面優(yōu)化后的最佳提取條件是否可靠，采用以上試驗條件進行提取，得到的產物中多糖含量為13.704 mg/mL，與預測值13.320 mg/mL十分接近，表明該模型可行。因此用響應面法優(yōu)化得到的最佳提取條件具有實用價值。

3 結論

通過對金針菇菌糠多糖提取溫度、水料比、時間三個條件的單因素試驗設計，并且針對這三個因素三水平的響應面進行分析，得到金針菇菌糠多糖的最佳提取工藝為：提取溫度95 ℃，提取時間4.26 h，提取水料比15∶1，此時多糖含量為13.704 mg/mL。

參考文獻：

[1] 王玉峰，王 旻，尹鴻萍.金針菇菌絲體中多糖的分離、結構鑒定及免疫學活性[J].中國天然藥物，2008，6（4）：312-315.

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[3] 葉 敏.金針菇多糖的提取及清除羥自由基活性研究[J].畢節(jié)學院學報（綜合版），2011，29（4）：90-94.

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[8] 劉曉牧，王中華，李福昌，等.菌糠的營養(yǎng)價值及其應用飼料與畜牧[J].飼料與畜牧，2000，8（6）：12-13.

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2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 提取時間對多糖含量的影響 由圖2可知，開始時，隨著提取時間的延長，多糖的含量處于上升的趨勢，提取時間為3.5～4.0 h時，多糖含量達到最高。其后，隨著提取時間的增加，多糖含量由于水解作用反而降低，故提取時間選擇4.0 h。

2.1.2 水料比對多糖含量的影響 由圖3可知，隨著水比例的增加，多糖含量呈先升高后降低的趨勢，勢，在水料比為15∶1時多糖含量達到最高，故選擇水料比為15∶1。

2.1.3 提取溫度對多糖含量的影響 由圖4可知，隨著提取溫度的升高，提取液中的多糖含量不斷上升，當提取溫度升至85～95 ℃時，多糖含量上升幅度趨于平緩。但過高的溫度可以使水分蒸發(fā)過多，有可能使多糖水解導致含量下降，所以溫度不宜超過95 ℃。

2.2 響應面試驗結果

對金針菇多糖的提取工藝進行響應面分析，試驗方案和結果見表2。

2.2.1 各因素間的相互影響 采用相應軟件Design-Expert進行響應面處理。將表2的試驗結果輸入軟件后可以得到時間-水料比、時間-溫度、溫度-水料比的相互關系圖。

從圖2至圖4中可以看出，水料比是影響提取多糖含量的最大因素，時間和溫度對提取含量的的影響程度相近。

2.2.2 最佳條件確定 從Design-Expert軟件中可以得到回歸方程：R=118.625 20+26.671 02X1-1.356 82X2-3.374 60X3-0.082 830X1X2-0.036 813 X1X3-0.003 94X2X3-2.574 49X12+0.036 728X22+0.020 640X32，通過軟件求偏微分方程得到最佳條件為：提取時間4.26 h，溫度95 ℃，水料比15∶1。為驗證用響應面優(yōu)化后的最佳提取條件是否可靠，采用以上試驗條件進行提取，得到的產物中多糖含量為13.704 mg/mL，與預測值13.320 mg/mL十分接近，表明該模型可行。因此用響應面法優(yōu)化得到的最佳提取條件具有實用價值。

3 結論

通過對金針菇菌糠多糖提取溫度、水料比、時間三個條件的單因素試驗設計，并且針對這三個因素三水平的響應面進行分析，得到金針菇菌糠多糖的最佳提取工藝為：提取溫度95 ℃，提取時間4.26 h，提取水料比15∶1，此時多糖含量為13.704 mg/mL。

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[3] 葉 敏.金針菇多糖的提取及清除羥自由基活性研究[J].畢節(jié)學院學報（綜合版），2011，29（4）：90-94.

[4] 劉 瑩，許 琳，趙 杰.金針菇多糖衍生物的制備及其抗菌性的測定[J].食品工業(yè)科技，2013，34（6）：137-139.

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[6] 馬壽福，軍 花，刁治民，等.食用菌菌糠營養(yǎng)價值及利用途徑的研究[J].青海草業(yè)，2006，15（3）：36-40.

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[8] 劉曉牧，王中華，李福昌，等.菌糠的營養(yǎng)價值及其應用飼料與畜牧[J].飼料與畜牧，2000，8（6）：12-13.

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