董政起 趙海婷，2 王韞哲，2 崔佳音，2 仲崇林

1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所，北京 100193；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江哈爾濱 150040；3.吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院，吉林長春 130021

慢性前列腺炎（chronic prostatitis，CP）是中青年男性的常見病、多發(fā)病，該病癥狀復(fù)雜，病程較長，且容易復(fù)發(fā)，嚴(yán)重影響患者的身心健康[1-2]。蒲芍前列腺炎膠囊系在研的新藥，是由土茯苓、蒲公英、牛膝、丹參、赤芍、紅花等十味中藥組成，具有清熱利濕，活血通淋之功效，用于慢性前列腺炎（屬于濕熱下注證者）[3-4]。該制劑是治療前列腺疾病的師傳經(jīng)驗(yàn)秘方，經(jīng)30多年臨床實(shí)踐，吸收現(xiàn)代醫(yī)學(xué)新成果，不斷總結(jié)與改進(jìn)，形成被臨床許多病例驗(yàn)證取得滿意療效的復(fù)方制劑。

在蒲芍前列腺炎膠囊中，丹參、赤芍和紅花需要乙醇提取脂溶性有效成分，且丹參及赤芍的用藥量在本方中最大，是該藥處方中的主藥。為此需要對(duì)乙醇提取技術(shù)條件進(jìn)行優(yōu)選，以提高提取效率，最大程度獲取丹參及赤芍的有效成分，發(fā)揮蒲芍前列腺炎膠囊的藥效。在現(xiàn)有的研究中[5-6]，通常只對(duì)丹參或赤芍的乙醇提取工藝以各自的主要成分為指標(biāo)進(jìn)行單獨(dú)考察，所優(yōu)化的條件不能滿足蒲芍前列腺炎膠囊的要求。因此，本研究采用正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)法，以丹參酮ⅡA和芍藥苷提得量為指標(biāo)，綜合考慮來選擇蒲芍前列腺炎膠囊的最佳提取工藝[7-10]，為生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)報(bào)道如下：

1 材料與方法

1.1 儀器

日本島津LC-9A高效液相色譜儀，SPD-6AV紫外檢測器，N2010色譜數(shù)據(jù)工作站（浙江大學(xué)智能信息工程研究所），分析天平AL104（梅特勒托利多儀器有限公司）；回流提取裝置（天津玻璃儀器廠）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）。

1.2 試藥

所用藥材均購于安徽亳州藥材市場；丹參酮ⅡA和芍藥苷對(duì)照品由中國生物制品檢定所提供，乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 工藝條件的選擇

本研究確定了影響提取效果的四個(gè)因素，即A：所用乙醇濃度；B：每次加乙醇量；C：每次提取時(shí)間；D：提取次數(shù)，并結(jié)合實(shí)際情況，本研究為每個(gè)因素確定了三個(gè)水平，見表1。筆者應(yīng)用正交試驗(yàn)以丹參酮ⅡA提得量和芍藥苷提得量為指標(biāo)，按L9（3）4正交表進(jìn)行試驗(yàn)。以處方量1/4為一份樣品（赤芍30 g、丹參50 g、紅花20 g），加乙醇回流提取，提取液減壓回收乙醇，濃縮液轉(zhuǎn)移至100 mL的量瓶中，甲醇定容，分別測定丹參酮ⅡA和芍藥苷含量。

表1 考察因素水平表

2.2 含量測定

2.2.1 丹參酮ⅡA含量測定方法

2.2.1.1 丹參酮ⅡA含量測定供試品液的制備 精密量取上述各濃縮液1 mL置50 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。

2.2.1.2 丹參酮ⅡA含量測定對(duì)照品溶液的制備 精密稱取丹參酮ⅡA對(duì)照品5 mg，置25 mL棕色量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻；精密量取2 mL，置25 mL棕色量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得（每1毫升中含丹參酮ⅡA 16.1 μg）。

2.2.1.3 丹參酮ⅡA含量測定方法學(xué)考察 ①色譜條件：用十八烷基硅烷鍵硅膠為填充劑，甲醇-水（73∶27）為流動(dòng)相，檢測波長為270 nm。理論板數(shù)按丹參酮ⅡA峰計(jì)算，應(yīng)不低于4000。②線性關(guān)系：分別精密吸取4.0、8.0、12.0、16.0、20.0 μL，注入高效液相色譜儀，按上述條件測定，以峰面積積分值為縱坐標(biāo)，丹參酮ⅡA的濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y=-797 026.50+46 075 057.45X，r=0.9997，線性范圍：0.0644～0.322 μg。 ③精密度試驗(yàn)：分別配制高、中、低（6.44、0.322、0.0644 μg/mL）3 種濃度的丹參酮ⅡA 樣品，按上述色譜條件分別于同一天內(nèi)測定3次，連續(xù)測定3 d。日內(nèi)精密度及日間精密度各組峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均小于2%。④重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批次樣品1 mL，共6份，按上述供試品溶液的制備及色譜條件測定，計(jì)算平均含量的RSD為1.9%。⑤加樣回收率試驗(yàn)：精密稱定已知含量的供試品6份，每份1 mL，置50 ml具塞棕色錐形瓶中，分別加入丹參酮ⅡA對(duì)照品溶液適量，按上述色譜條件分別測定，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果顯示：6組樣品的加樣回收率分別為99.32%、100.42%、98.87%、99.63%、101.13%、97.88%，RSD均小于2%。⑥穩(wěn)定性試驗(yàn)：取濃度為0.322 μg/mL的丹參酮ⅡA 樣品室溫放置 0、2、4、6、8、12 h，按上述條件進(jìn)行測定，結(jié)果顯示：丹參酮ⅡA濃度在12 h內(nèi)濃度無明顯變化，穩(wěn)定性好，RSD小于2%。

2.2.1.4 丹參酮ⅡA樣品含量測定 精密吸取供試品液、對(duì)照品溶液10 μL進(jìn)樣，注入液相色譜儀，測定峰面積，以外標(biāo)法計(jì)算，即得。

2.2.2 芍藥苷含量測定方法的建立

2.2.2.1 芍藥苷含量測定供試品液制備 精密量取上述各濃縮液1.5 mL置50 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液10 mL，至10 mL量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.2.2 芍藥苷含量測定對(duì)照品溶液的制備 精密稱取芍藥苷對(duì)照品適量，加甲醇制成每毫升中含芍藥苷0.193 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.2.2.3 芍藥苷含量測定方法學(xué)考察 ①色譜條件：用十八烷基硅烷健合硅膠為填充劑；甲醇-水（35∶65）為流動(dòng)相；檢測波長為230 nm；流速1.0 mL/min。理論板數(shù)以芍藥苷峰（C23H28O11）計(jì)算應(yīng)不低于3000。②線性關(guān)系：分別精密吸取 2、4、6、8、10 μL，注入高效液相色譜儀，按上述條件測定，以峰面積積分值為縱坐標(biāo)，芍藥苷的濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程回 歸 方 程 ：Y ＝ -35 241.360＋1 349 289.119X，r=0.9999，線性范圍：0.386～1.930 μg。 ③精密度試驗(yàn)：分別配制高、中、低（38.6、1.93、0.386 μg/mL）3 種濃度的芍藥苷樣品，按上述色譜條件分別于同一天內(nèi)測定3次，連續(xù)測定3 d。日內(nèi)精密度及日間精密度各組峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD均小于2%。④重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批次樣品1.5 mL，共6份，按上述供試品溶液的制備及色譜條件，測定，計(jì)算含量。結(jié)果顯示，平均含量的RSD為1.1%。⑤加樣回收率試驗(yàn)：精密稱定已知含量的供試品6份，每份 1.5 mL，置50 mL具塞錐形瓶中，分別加入芍藥苷對(duì)照品溶液適量，按上述色譜條件分別測定，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果顯示：6組樣品的加樣回收率分別為98.82%、97.45%、100.87%、100.15%、98.35%和99.92%，RSD均小于2%。⑥穩(wěn)定性試驗(yàn)：取濃度為1.93 μg/mL的芍藥苷樣品室溫放置 0、2、4、6、8 和 12 h，按上述條件進(jìn)行測定，結(jié)果顯示：芍藥苷濃度在12 h內(nèi)濃度無明顯變化，穩(wěn)定性好，RSD小于1%。

2.2.2.4 芍藥苷樣品含量測定 精密吸取供試品液、對(duì)照品溶液10 μL進(jìn)樣，注入液相色譜儀，測定峰面積，以外標(biāo)法計(jì)算，即得。

2.3 方差分析結(jié)果

方差分析結(jié)果表明：影響丹參酮ⅡA得量的主要因素依次為 B（乙醇用量）、A（乙醇濃度）、D（提取次數(shù)）、C（提取時(shí)間）；影響芍藥苷得量的主要因素依次為 D（提取次數(shù)）、A（乙醇濃度）、B（乙醇用量）、C（提取時(shí)間）。綜合上述兩項(xiàng)試驗(yàn)結(jié)果并考慮生產(chǎn)成本因素，確定為A1B1C3D1，即80%乙醇加熱回流提取3次，每次1.0 h，每次加醇量分別為6倍，此為蒲芍前列腺炎膠囊的最佳乙醇提取工藝。丹參酮ⅡA和芍藥苷含量及方差分析結(jié)果見表2～5。

表2 正交試驗(yàn)表及試驗(yàn)結(jié)果（以丹參酮ⅡA為指標(biāo)）

表3 方差分析

表4 正交試驗(yàn)結(jié)果（以芍藥苷為指標(biāo)）

表5 方差分析

3 討論

蒲芍前列腺炎膠囊主要由活血化瘀藥味組成，已有研究報(bào)道丹參、赤芍、紅花有改善微循環(huán)、減輕炎性反應(yīng)、抑制結(jié)締組織增生作用，同時(shí)也有免疫調(diào)節(jié)作用[11]。此外，丹參酮ⅡA和芍藥苷作為單體化合物，也被證明具有抑制炎性免疫反應(yīng)作用，可抑制淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞釋放類似的生長因子，從而減少了層粘連蛋白合成，促使前列腺炎癥減輕，纖維化程度減弱[12-13]。因此筆者選擇丹參酮ⅡA和芍藥苷為乙醇提取工藝優(yōu)化的指標(biāo)性成分是有一定科學(xué)依據(jù)的。丹參酮ⅡA和芍藥苷不但是本方中君藥的主要成分，也是本方發(fā)揮藥理作用的關(guān)鍵有效成分。

丹參酮ⅡA、芍藥苷的含量測定方法，本研究在參照《中國藥典》2010年版[9]規(guī)定及相關(guān)文獻(xiàn)[14-15]的基礎(chǔ)上，優(yōu)化出符合本提取工藝的高效液相色譜條件。該方法簡便、準(zhǔn)確、專屬性強(qiáng)，也可用于該制劑的質(zhì)量控制。

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