楊 青 趙麗君 周大江 高瑞希 楊光忠 李 竣

1.湖北省棗陽市第一人民醫(yī)院藥劑科，湖北棗陽 441200；2.中南民族大學藥學院，湖北武漢 430074

山竹（Garcinia mangostana L.）為藤黃科（Guttirae）山竹子屬藥食兩用水果，廣泛分布于馬來西亞、緬甸、泰國等東南亞國家，現(xiàn)已有大量栽培。山竹果中富含黃酮、多糖、蛋白質(zhì)和脂類等化合物，是我國傣族及東南亞國家常用的傳統(tǒng)藥用植物。山竹果實主要化學成分為呫噸酮化合物[1]，現(xiàn)代藥理學表明山竹果實具有抗炎、抗菌、抗氧化等多種生物活性[2]，山竹果皮中存在的氧雜蒽酮類化合物具有對脂肪酸合酶 （FAS）全反應的抑制作用[3]。楊連珍[4]發(fā)現(xiàn)山竹果（7周成熟期）中3種含異戊二烯基均含有一種對人類癌細胞具有一定抗性的成分。有研究發(fā)現(xiàn)山竹能夠加速豚鼠的皮膚創(chuàng)面愈合，重造創(chuàng)面上皮化[5]。山竹對燒傷的創(chuàng)面有一定的抑菌作用，同時減輕表面液體滲出，促進傷口愈合的作用[6-8]。研究表明山竹子根乙醇提取物對細胞分泌HBsAg、HBeAg有抑制作用[9]。通過對嶺南山竹子藥用的研究發(fā)現(xiàn)，嶺南山竹子對小鼠熱板致痛、輻射熱甩尾反應和化學致痛有明顯的抑制作用，可明顯減少小鼠自主活動；對二甲苯所致小鼠耳部腫脹以及對大鼠蛋清性足腫脹和棉球肉芽腫有明顯的抑制作用[10]。對山竹子根皮進行抗寄生蟲活性成分研究表明，發(fā)現(xiàn)其具有中等抗惡性瘧原蟲與布氏錐蟲的活性，顯示較強的選擇性抗寄生蟲活性和細胞毒性[11]。山竹果皮提取的總黃酮對羥自由基、超氧陰離子自由基具有清除作用，并能有效地清除亞硝酸鹽和阻斷亞硝胺的合成，清除體內(nèi)亞硝酸鹽和阻斷亞硝胺的合成是防治癌癥的有效途徑[12]。戴聰杰等[13]采用化學分析方法對山竹的水分、灰分、粗蛋白、粗脂肪、水解氨基酸和碳水化合物等成分的含量進行測定，研究顯示山竹的營養(yǎng)非常豐富，是很有發(fā)展前途的營養(yǎng)食品資源。同時研究顯示山竹提取物具有很好的美白、保濕、抗衰老的功效[14]。為了更好地使用和開發(fā)山竹藥用價值，本研究測定了山竹新鮮果肉提取物中的多糖、蛋白質(zhì)含量及果品提取物中總黃酮的含量，分析了果肉中多糖的組成成分，為山竹的產(chǎn)業(yè)化開發(fā)提供一定的理論依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 試劑

牛血清蛋白及考馬斯亮藍G-250（超級純，廣州微佳科技有限公司），D-葡萄糖 （98.0%，Aladdin industrial Corporation），蘆?。ㄖ袊幤飞镏破窓z定所，批號 10080-200707），標準單糖（Sigma 公司），三甲基氯硅烷，六甲基二硅醚烷，吡啶，三氟乙酸，硼氫化鈉，氫氧化鈉，95%乙醇（工業(yè)），濃硫酸、苯酚、亞硝酸鈉、硝酸鋁等所用試劑均為分析純。

1.2 材料

山竹于2010年9月購于武漢沙湖水果批發(fā)市場，經(jīng)中南民族大學藥學院李竣副教授鑒定為Garcinia mangostana L.的果實，提取物供試品由中南民族大學藥學院制備。

1.3 儀器

紫外可見分光光度計（UV-1800UV美譜達），氣相色譜儀（6890N Network GC System ，美國 Agilent），旋轉蒸發(fā)器RE-52（上海亞榮生化儀器），真空干燥箱（XMTD-8222型，上海精宏實驗設備），恒溫干燥箱（上海索譜儀器），超低溫冷凍儲存箱（中科美菱），低速離心機（TD25型，長沙平凡儀器儀表），冷凍干燥機（FD-1B-50型，北京博醫(yī)康實驗儀器），旋轉蒸發(fā)儀R-1001M型（鄭州長城），循環(huán)水式多用真空泵SHB-Ⅲ（鄭州長城），恒溫水浴鍋（鄭州長城），超聲波清洗器KQ-500E（昆山市超聲儀器），硅膠板試劑（青島海洋化工廠），電子天平AB265-S型，電子天平AR2140型（上海奧豪斯儀器）。

2 方法與結果

2.1 提取工藝流程

取新鮮山竹果皮干燥粉碎后的6.4 kg，用95%乙醇各回流提取3次，每次2 h，合并提取液減壓濃縮得到山竹果皮提取物。取新鮮的山竹果肉854 g分別依次用95%乙醇提取1次，蒸餾水回流提取3次，每次2 h，合并蒸餾水提取液，減壓濃縮得到山竹果肉提取物。

2.2 山竹果肉提取物多糖含量的測定[15]

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取干燥至恒重的葡萄糖50 mg，加蒸餾水溶解定容至0.1 mg/mL，即得對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密稱取干燥的山竹果肉提取物適量，至100 mL容量瓶，加蒸餾水至刻度，搖勻即得供試品溶液。

2.2.3 苯酚溶液的制備 稱取苯酚6 g至100 mL容量瓶，加蒸餾水至刻度，搖勻即得苯酚試劑。

2.2.4 最大檢測波長的選擇 分別取對照品溶液和供試品溶液1 mL至10 mL具塞玻璃試管中，加苯酚溶液0.5 mL，振搖，迅速加入濃硫酸5 mL，振搖后放置15 min。待冷卻后，紫外分光光度計上做全波長掃描，得到最大吸收波長λmax為480 nm，確定480 nm為檢測波長。

2.2.5 標準曲線的繪制 精密量取對照品溶液1、2、3、4、5 mL，分別加蒸餾水定容至10 mL容量瓶中。搖勻各取1 mL，以下操作按“2.2.4”項下方法顯色。在480 nm波長下測定吸光度，求得標準曲線性方程為y=17.0888x+0.0108，r=0.9980，提示該溶液在 0.01～0.05 mg/mL范圍內(nèi)線性關系良好。

2.2.6 精密度試驗 取0.05 mg/mL的對照品溶液按“2.2.4”項下方法顯色，結果顯示RSD為0.226%（n=6）。

2.2.7 重復性試驗 取同一批次供試品溶液，按“2.2.4”項下方法顯色，結果顯示RSD為2.85%（n=6）。

2.2.8 穩(wěn)定性試驗 取同一批次供試品溶液，按“2.2.4”項下方法顯色，分別在顯色 0、5、10、20、30、40 min 后測定吸光度值，RSD為2.87%，結果表明顯色后40 min內(nèi)測定測定無顯著性差異，為保證準確性測定的時間選擇在30 min內(nèi)完成。

2.2.9 回收率試驗 精密吸取葡萄糖對照品溶液6份，分別加入不同量的已知多糖含量的供試品液，以下操作按“2.2.4”項下方法進行。結果見表1。

表1 山竹果肉多糖加樣回收率（n=6）

2.2.10 供試品含量測定 取果肉提取物供試品溶液，按“2.2.4”項下方法進行，山竹果肉提取物中多糖含量，結果見表2。

表2 山竹果肉提取物多糖含量（n=3）

2.3 山竹果肉提取物蛋白質(zhì)含量的測定[16]

2.3.1 對照品溶液的制備 精密稱取250 mg牛血清蛋白（BSA），加生理鹽水制成濃度為0.1 mg/mL的溶液，即得對照品溶液；精密稱取50 mg考馬斯亮藍G-250至500 mL容量瓶中，加入25 mL 95%乙醇﹑50 mL 85%磷酸，振搖溶解，生理鹽水定容得考馬斯亮藍溶液。

2.3.2 供試品溶液的制備 精密稱取干燥的山竹果肉提取物適量，至250 mL容量瓶，加蒸餾水至刻度，搖勻即得供試品溶液。

2.3.3 最大檢測波長的選擇 分別取對照品溶液和供試品溶液1 mL，加考馬斯亮藍溶液5 mL，搖勻，靜置2 min。紫外分光光度計上做全波長掃描，得到最大吸收波長λmax為590 nm，確定590 nm為檢測波長。

2.3.4 標準曲線的繪制 精密量取對照品溶液0、0.8、1.4、2.0、2.6、3.2 mL，分別加蒸餾水定容至 10 mL 容量瓶中。搖勻各取1 mL，以下操作按“2.3.3”項下方法顯色。在590 nm波長下測定吸光度，求得標準曲線性方程為y=25.0039x+0.0496，r=0.9997，提示該溶液在0.008～0.032 mg/mL范圍內(nèi)線性關系良好。

2.3.5 精密度試驗 取0.01 mg/mL的對照品溶液按“2.3.3”項下方法顯色，結果顯示RSD為0.29%（n=6）。

2.3.6 重復性試驗 取同一批次供試品溶液，按“2.3.3”項下方法顯色，結果顯示RSD為2.79%（n=6）。

2.3.7 穩(wěn)定性試驗 取同一批次供試品溶液，按“2.3.3”項下方法顯色，分別在顯色 0﹑5﹑10﹑15﹑20﹑25﹑30 min后測定吸光度值，RSD為3.21%，結果表明顯色后30 min內(nèi)測定測定無顯著性差異，為保證準確性測定的時間選擇在20 min內(nèi)完成。

2.3.8 回收率試驗 精密吸取BSA對照品6份，分別加入不同量的已知含量的供試品液，以下操作按“2.3.3”項下方法進行，結果見表3。

表3 山竹果肉提取物蛋白質(zhì)加樣回收率（n=6）

2.3.9 供試品含量測定 取山竹果肉提取物供試品溶液，按“2.2.4”項下方法進行，山竹果肉提取物中蛋白質(zhì)含量，結果見表4。

表4 山竹果肉提取物中蛋白質(zhì)含量（n=3）

2.4 山竹果皮提取物總黃酮含量的測定[17]

2.4.1 對照品、供試品溶液的制備 取蘆丁對照品10 mg，用95%乙醇溶解，并定容至100 mL，即得0.1 mg/mL對照品溶液，精密稱取山竹果皮提取物于100 mL容量瓶中加95%乙醇溶解定容即得供試品溶液。配制5%NaNO3溶液，10%Al（NO3）3溶液，20%NaOH 溶液。

2.4.2 最大檢測波長的測定 分別取對照品溶液和供試品溶液4 mL，置于25 mL容量瓶中，加5%NaNO3溶液 1 mL，搖勻放置 6 min，加 10%Al（NO3）3溶液 1 mL，搖勻放置6 min，加20%NaOH試液10 mL，再加蒸餾水定容，搖勻放置15 min，以95%乙醇為空白參比。紫外分光光度計上做全波長掃描，得到最大吸收波長λmax為500 nm，確定500 nm為檢測波長。

2.4.3 校準曲線的繪制 精密量取對照品溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，分別加蒸餾水定容至 10 mL容量瓶中。搖勻各取1 mL，以下操作按“2.4.2”項下方法顯色。在500 nm波長下測定吸光度，求得標準曲線性方程為y=9.3890x+0.0307，r=0.9971，提示該溶液在0.02～0.06 mg/mL范圍內(nèi)線性關系良好。

2.4.4 精密度試驗 取對照品溶液按“2.4.2”項下方法顯色，測定吸收度值連續(xù)測定6次，RSD=0.328%（n=6）。

2.4.5 重復性試驗 取同一批號的供試品（批號100105）制備6份供試品溶液，按“2.4.2”項下方法操作顯色，測定吸收度值RSD=3.14%（n=6）。

2.4.6 穩(wěn)定性試驗 取對照品試液按“2.4.2”項下方法操作顯色，在顯色10、20、30 min后測定吸收度值，結果表明顯色后30 min內(nèi)測定測定無顯著性差異，為保證準確性測定的時間選擇在20 min內(nèi)完成。

2.4.7 回收率試驗 精密吸取蘆丁對照品6份，分別加入不同量的已知含量的供試品液，以下操作按“2.4.2”項下方法進行，結果見表5。

表5 山竹果皮提取物總黃酮加樣回收率（n=6）

2.4.8 供試品含量的測定 取山竹果皮提取物供試品溶液，按“2.4.2”項下方法進行，山竹果皮提取物中總黃酮含量，結果見表6。

表6 山竹果皮提取物總黃酮含量（n=3）

2.5 山竹果肉提取物多糖成分分析

2.5.1 多糖提取 稱取15 g山竹果肉提取物，加蒸餾水150 mL，于90℃水浴加熱2.5 h，離心過濾。濾液用Sevage 試液（氯仿∶正丁醇=4∶1，體積比）按 1∶5 充分混勻，振蕩25 min，4000 r/min離心15 min，收集上清液，重復處理至氯仿與水層間無膠狀物產(chǎn)生。加入無水乙醇至醇濃度為70%，4℃靜置12 h，過濾，冷凍干燥得較純多糖[18-19]。

2.5.2 多糖水解，單糖還原 取0.5～1.0 mg多糖溶解在1 mL 4 mol/L的三氟乙酸（TFA）中，充氮氣加蓋密封，100℃水解4 h，用氮氣除水。水解糖樣溶于0.5 mL 0.05 mol/L氫氧化鈉溶液，加5～10 mg硼氫化鈉，在60℃還原1 h，加乙酸至無氣泡逸出。將產(chǎn)物冷凍干燥，加1 mL甲醇并振蕩溶解，用氮氣除甲醇，反復5次除去硼酸根。產(chǎn)物在含有五氧化二磷的真空干燥箱中干燥5 h。

2.5.3 單糖甲基化，氣相色譜分析 干燥產(chǎn)物加1 mL 4A分子篩干燥的吡啶，振蕩溶解，再依次加入0.5 mL六甲基二硅醚烷，0.2 mL三甲基氯硅烷，振蕩，混合均勻，置4℃冰箱反應12 h，產(chǎn)物用離心機離心8 min（4000 r/min），取上清液進行氣相分析。氣相色譜條件為：HP-5 石英毛細管色譜柱（30 m×0.32 mm，0.25 μm），程序升溫范圍130～290℃，每分鐘升高10℃，進樣口溫度 295℃，載氣氮氣流速 1.0 mL/min，分流比 50∶1，檢測器溫度300℃。在此方法下對各單糖（圖1）和提取物多糖（圖2）進行檢測并得到相關氣相色譜圖。各單糖、提取物多糖氣相色譜圖分別見圖1、2。

圖1 單糖混合液氣相色譜測定結果

圖2 山竹多糖氣相色譜測定結果

2.5.4 標準單糖和提取物多糖氣相色譜 將標準單糖和多糖分別進樣進行氣相分析，結果見表7、8。其中氣相色譜的保留時間可以確定單糖種類，色譜峰面積可以估算單糖含量。從表7顯示的結果說明，7種單糖保留時間主要集中在8～11 min，部分色譜峰還未達到基線的分離，果糖因其結構的變化產(chǎn)生兩個信號，其他單糖均為一個信號。

表7 各單糖氣相色譜分析結果

表8 山竹果肉提取物多糖氣相色譜結果

從圖1、2可明確看出山竹果肉提取物多糖結果中的D-木糖、D-阿拉伯糖、D-果糖、D-葡萄糖與各單糖相對應，結合表7和表8保留時間表明山竹果肉提取物多糖由D-木糖、D-阿拉伯糖、D-果糖、D-葡萄糖組分，摩爾比為 1.34∶1.66∶1.00∶40.06。

3 討論

通過文獻的調(diào)研發(fā)現(xiàn)，對山竹提取物質(zhì)量的研究，總黃酮含量的測定主要集中在果皮，多糖和蛋白質(zhì)等的含量測定集中在果肉，筆者前期分別對山竹果皮提取物中多糖和蛋白質(zhì)含量以及果肉中總黃酮含量進行測定，測定結果表明山竹果皮提取物中多糖含量為27.12%，蛋白質(zhì)含量為4.84%，山竹果肉提取物中總黃酮含量為0.39%。與本研究中含量測定結果相比較，果肉提取物中多糖含量遠大于果皮提取物，而果皮中富含有黃酮類成分。

本實驗用苯酚-硫酸法測定山竹果肉提取物的含糖量，該法反應迅速完全，產(chǎn)生的有色物質(zhì)穩(wěn)定準確率較高，并且顯色反應與多糖濃度存在定量關系，簡便快速，靈敏易行，可以用于多糖的含量測定。實驗過程中，854 g新鮮的山竹果肉可以得到多糖提取物131 g，測定多糖含量為84.99%，換算新鮮山竹果肉中含糖量為13%。用NaNO3-Al（NO3）3的方法測定總黃酮的含量，并且精密度良好在30 min內(nèi)穩(wěn)定，在20 min內(nèi)完成測定，此法方便可行可以用于山竹總黃酮含量的測定。

實驗采用氣相色譜法將山竹果肉提取物多糖進行了分析，山竹果肉提取物多糖由D-葡萄糖、D-木糖、D-阿拉伯糖和D-果糖組組成，摩爾比為1.34∶1.66∶1.00∶40.06。有一種單糖因單糖對照品有限未有確定，從各種單糖摩爾比例可以看出山竹果肉提取物多糖是由葡萄糖為主的葡聚糖組成的雜多糖，具體的鏈接方式還需要更多的實驗數(shù)據(jù)予以證實。

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