邱 燁

浙江省湖州市南潯區(qū)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院檢驗(yàn)科，浙江湖州 313009

PC12細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生的神經(jīng)軸突能作為研究神經(jīng)退行性疾病及脊柱損傷的研究模型[1-2]，也是研究神經(jīng)內(nèi)分泌試驗(yàn)的模型[3]。細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)是分子生物學(xué)及基因工程關(guān)鍵步驟之一[4]，也是體外研究神經(jīng)細(xì)胞特定基因表達(dá)調(diào)控及遺傳病基因治療的重要技術(shù)之一[5]，但常用的陽(yáng)離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑對(duì)PC12細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率低[1，6-8]。 本研究參照相關(guān)文獻(xiàn)[8-10]，通過(guò)在陽(yáng)離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染過(guò)程中加入氯喹及亞精胺，同時(shí)調(diào)整陽(yáng)離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑與DNA用量的比例和轉(zhuǎn)染時(shí)間，實(shí)現(xiàn)提高PC12細(xì)胞轉(zhuǎn)染率，且未影響細(xì)胞的正常功能，為PC12細(xì)胞進(jìn)行神經(jīng)細(xì)胞基因功能及開發(fā)遺傳病治療方案等生物學(xué)研究提供了一種安全、廉價(jià)的新方法。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

主要試劑：PC12 細(xì)胞（American Culture Collection），RPMI1640 培養(yǎng)基 （Sigma 公司），Lipofectamine2000（Invitrogen 公司），F(xiàn)uGENE HD （Roche 公司），PolyJet（Signagen Laboratoies 公 司 ），Lipofectamine LTX and Plus（Invitrogen 公司），pEGFP-N1（BD Biosciences 公司），氯喹（Sigma 公司），亞精胺（Sigma 公司），Ⅰ型牛膠原蛋白 （BD Biosciences公司），神經(jīng)生長(zhǎng)因子（NGF）（Peprotech 公司），噻唑藍(lán)（MTT）（Sigma 公司）。Axiovert 100 M倒置熒光顯微鏡 （Carl Zeiss公司），MetaMorph圖像分析處理軟件 （Molecular Devices公司），EL808 酶標(biāo)儀（Bio-Tek Instrument公司）。

1.2 方法

1.2.1 PC12細(xì)胞培養(yǎng) PC12細(xì)胞培養(yǎng)參照相關(guān)文獻(xiàn)[11-12]，細(xì)胞密度至 70%左右時(shí)進(jìn)行傳代，傳至 2～3代的PC12細(xì)胞備用。

1.2.2 PC12細(xì)胞轉(zhuǎn)染 PC12細(xì)胞培養(yǎng)參照文獻(xiàn)[11]的方法，轉(zhuǎn)染的基本步驟[8]：將 4 μL Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑加入75 μL不含血清的新鮮RPMI 1640培養(yǎng)基中混勻，同時(shí)將1 μg質(zhì)粒 pEGFP-N1加入150 μL不含血清的新鮮RPMI 1640培養(yǎng)基中孵育5 min后將兩溶液混勻，室溫靜置30 min，另將含（或不含）36 mmol/L氯喹、32 μmol/L亞精胺的無(wú)血清 RPMI 1640培養(yǎng)基75 μL加入上述陽(yáng)離子脂質(zhì)體/DNA復(fù)合物，移去細(xì)胞培養(yǎng)液后加入以上陽(yáng)離子脂質(zhì)體/DNA復(fù)合物，培養(yǎng)4 h后再棄去上述含陽(yáng)離子脂質(zhì)體/DNA復(fù)合物的細(xì)胞培養(yǎng)液，換成新鮮含5%胎牛血清、10%小牛血清的 RPMI 1640培養(yǎng)基，每室 300 μL。再培養(yǎng)48 h，然后在Axiovert 100 M倒置熒光顯微鏡，物鏡40×和目鏡10×放大倍數(shù)下拍照及計(jì)數(shù)分析。見圖1（封三）。

圖1 本法與Lipofectamine 2000法對(duì)PC12細(xì)胞增強(qiáng)綠色熒光蛋白表達(dá)比較

1.2.3 四甲基偶氮唑鹽（MTT）試驗(yàn) 參照文獻(xiàn)[1]方法，用MTT試驗(yàn)分別測(cè)定對(duì)照孔、在轉(zhuǎn)染過(guò)程中加（或不加）氯喹與亞精胺孔的PC12細(xì)胞活性。

1.2.4 PC12細(xì)胞神經(jīng)軸突生長(zhǎng)試驗(yàn) 按文獻(xiàn)方法[11]，PC12細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，將細(xì)胞培養(yǎng)基換成含1%胎牛血清、含（或不含）100 ng/mL神經(jīng)生長(zhǎng)因子（NGF）的新鮮RPMI 1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)5 d后，在倒置熒光顯微鏡物鏡40×和目鏡10×放大倍數(shù)下拍照及計(jì)數(shù)分析見圖2（封三）。

圖2 本法與Lipofectamine 2000法對(duì)PC12細(xì)胞神經(jīng)軸突生長(zhǎng)比較

1.2.5 轉(zhuǎn)染效率與神經(jīng)軸突判定及統(tǒng)計(jì) PC12細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，計(jì)數(shù)綠色熒光蛋白陽(yáng)性的細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的百分比即為轉(zhuǎn)染效率。參照文獻(xiàn)方法[11]，用Meta Morph圖像分析處理軟件計(jì)數(shù)并測(cè)量PC12細(xì)胞神經(jīng)軸突的長(zhǎng)度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 15.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，正態(tài)分布計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩獨(dú)立樣本的計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DNA與Lipofectamine 2000的比例對(duì) PC12細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率的影響

當(dāng)質(zhì)粒 pEGFP-N1的用量為 1 μg時(shí)，Lipofectam ine2000用量相對(duì)較低時(shí)，PC12細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率與Lipofectamine2000用量呈正相關(guān)，但隨著Lipofectam ine2000用量超過(guò) 4 μL，其毒副作用逐漸明顯，導(dǎo)致PC12細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率逐步降低，且綠色熒光蛋白陽(yáng)性細(xì)胞的死亡率明顯增加，本研究結(jié)果表明，對(duì)PC12細(xì)胞轉(zhuǎn)染，DNA∶Lipofectamine2000 用量比例應(yīng)控制在 1∶4。

2.2 轉(zhuǎn)染時(shí)間對(duì)PC12細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率的影響

當(dāng)轉(zhuǎn)染時(shí)間分別為 1、2、4、8、24 h 時(shí)，PC12 細(xì)胞轉(zhuǎn)染率分別為 35.5%、37.9%、40.5%、40.3%及 38.6%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在未達(dá)到最佳轉(zhuǎn)染時(shí)間前，轉(zhuǎn)染效率隨轉(zhuǎn)染時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，4 h達(dá)到最大轉(zhuǎn)染效率，但在超過(guò)4 h后轉(zhuǎn)染時(shí)間后，轉(zhuǎn)染效率則會(huì)緩慢降低。

2.3 氯喹、亞精胺用量對(duì)PC12細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率的影響

隨著氯喹、亞精胺加入濃度的增加，PC12細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率也隨之增加，當(dāng)氯喹、亞精胺加入終濃度分別增至 9 μmol/L和 8 μmol/L時(shí)，PC12細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率最高，轉(zhuǎn)染效率為40.5%。

2.4 氯喹、亞精胺對(duì)PC12細(xì)胞活性的影響

PC12細(xì)胞在轉(zhuǎn)染過(guò)程中加入終濃度為9 μmol/L氯喹與8 μmol/L亞精胺前、后MTT試驗(yàn)吸光度（590 nm）分別為（0.466±0.042）與（0.451±0.038），差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），表明PC12細(xì)胞的活性無(wú)影響。

2.5 氯喹、亞精胺對(duì)PC12細(xì)胞神經(jīng)軸突生長(zhǎng)的影響

轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000對(duì)轉(zhuǎn)染前后的PC12細(xì)胞及經(jīng)NGF誘導(dǎo)后產(chǎn)生的神經(jīng)軸突長(zhǎng)度無(wú)影響。氯喹、亞精胺對(duì)PC12細(xì)胞的神經(jīng)軸突生長(zhǎng)數(shù)量與長(zhǎng)度無(wú)影響；也間接表明在轉(zhuǎn)染過(guò)程中加入9 μmol/L氯喹及8 μmol/L亞精胺對(duì)PC12細(xì)胞的功能無(wú)影響。見表1。

表1 氯喹、亞精胺對(duì)PC12細(xì)胞神經(jīng)軸突生長(zhǎng)的影響（±s）

表1 氯喹、亞精胺對(duì)PC12細(xì)胞神經(jīng)軸突生長(zhǎng)的影響（±s）

方法 神經(jīng)軸突數(shù)量（個(gè)） 神經(jīng)軸突長(zhǎng)度（μm）Lipofectamine 20002.41±0.1246.6±7.12本法2.48±0.1144.9±6.95 P值 ＞0.05＞0.05

2.6 本法與4種常用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑對(duì)PC12細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率的比較

本文以pEGFP-N1為報(bào)告基因，用本法與常用的FuGENE、PolyJet、Lipofectamine LTX and Plus、Lipofectamine2000等4種脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑對(duì)PC12細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率進(jìn)行了比較，結(jié)果：本法的PC12細(xì)胞轉(zhuǎn)染率為40.5%，其它四種脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑對(duì)PC12細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率分別為10.5%、8.6%、11.8%及15.3%。本法對(duì)PC12細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率明顯高于其他4種脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見圖3。

圖3 本法與4種常用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑對(duì)PC12細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率的比

3 討論

PC12細(xì)胞具有類似神經(jīng)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變及生理學(xué)特征而作為神經(jīng)研究的模式細(xì)胞[1]。氯喹、亞精胺能明顯提高PC12細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率，且不影響PC12細(xì)胞的活性與正常功能，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[1，8]。

氯喹是一種疏水性的弱堿，在PC12細(xì)胞轉(zhuǎn)染過(guò)程中能進(jìn)入細(xì)胞吞噬溶酶體，在酸性環(huán)境下被質(zhì)子化，隨著質(zhì)子化的氯喹在吞噬溶酶體的累積，吞噬溶酶體開始腫脹，其包膜穩(wěn)定性破壞，導(dǎo)致陽(yáng)離子脂質(zhì)體/DNA復(fù)合物釋放入細(xì)胞漿，同時(shí)，氯喹抑制吞噬溶酶體酸化與成熟，阻止陽(yáng)離子脂質(zhì)體/DNA復(fù)合物在溶酶體中的降解[8-9]，轉(zhuǎn)染過(guò)程中氯喹能提高PC12細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率與上述氯喹的作用機(jī)制有關(guān)。亞精胺是一種多胺類制劑能通過(guò)增強(qiáng)DNA的復(fù)制與轉(zhuǎn)錄作用來(lái)提高PC12細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率，同時(shí)能增強(qiáng)報(bào)告基因的表達(dá)強(qiáng)度[8]。

當(dāng) DNA：Lipofectamine2000 比 小 于 1∶4 時(shí) ，Lipofectamine2000用量相對(duì)過(guò)多，N∶P比增加，陽(yáng)離子脂質(zhì)體/DNA復(fù)合物表面所帶的凈正電荷增多，PC12轉(zhuǎn)染效率也隨之增加[6]，但對(duì) PC12細(xì)胞毒性作用也隨之增強(qiáng)，這與部分結(jié)合的Lipofectamine從陽(yáng)離子脂質(zhì)體/DNA復(fù)合物中分離，引起Lipofectamine內(nèi)化而損傷細(xì)胞或破壞帶負(fù)電荷的細(xì)胞膜而影響PC12細(xì)胞的狀態(tài)，PC12細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率與細(xì)胞活性也會(huì)降低[1]，及時(shí)更換RPMI1640培養(yǎng)基可以減少其毒性作用。

本文得到美國(guó)伊利諾斯州立大學(xué)芝加哥分校醫(yī)學(xué)院Beatrice Y.J.T.Yue教授指導(dǎo)，特此致謝！

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