沈 潔，劉 洋

0 引言

肝缺血再灌注損傷(Hepatic ischemic reperfusion injury，HIRI)是肝臟外科疾病中常見的病理過程。在肝臟移植、肝臟良惡性腫瘤、外傷等進(jìn)行的肝部分切除等需要阻斷入肝血流的手術(shù)中，不可避免造成肝缺血再灌注損傷，進(jìn)而使肝解毒能力降低、微循環(huán)阻力升高，嚴(yán)重者可引起肝功能的損害甚至肝衰竭。對肝臟手術(shù)圍術(shù)期的肝保護(hù)方面的研究也越來越受到麻醉醫(yī)生和外科醫(yī)生的關(guān)注。因此，對HIRI的研究具有重要的理論意義和實(shí)用價(jià)值。

預(yù)處理(Preconditioning，PC)作為機(jī)體內(nèi)源性保護(hù)現(xiàn)象，在臨床上越來越受到人們的關(guān)注。預(yù)處理分為缺血、缺氧預(yù)處理和藥物預(yù)處理(應(yīng)用某種藥物而產(chǎn)生預(yù)處理作用)。由于缺血、缺氧預(yù)處理本身是傷害性應(yīng)激過程，對機(jī)體是一種創(chuàng)傷，使其在臨床上的應(yīng)用受到限制。藥物預(yù)處理具有相對安全、方便、劑量易于控制等優(yōu)點(diǎn)，成為近年來研究的熱點(diǎn)。線粒體三磷酸腺苷敏感性鉀通道(Mitochondrial adenosine triphosphate-sensitive potassium channel，mitoKATP)在預(yù)處理中起著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，吸入麻醉藥預(yù)處理(Volatile anesthetic preconditioning，VAPC)的心肌保護(hù)作用與mitoKATP開放有關(guān)。線粒體是一個(gè)結(jié)構(gòu)和功能復(fù)雜而敏感的重要細(xì)胞器，在細(xì)胞凋亡過程中的多個(gè)關(guān)鍵性步驟都涉及線粒體。研究表明，缺血引起細(xì)胞不可逆損傷的根本原因是線粒體Ca2+超載，線粒體通透性轉(zhuǎn)運(yùn)通道(Mitochondrial permeability transition pore，MPTP)參與了神經(jīng)損傷，并且是缺血再灌注所致腦細(xì)胞損傷的關(guān)鍵部位。隨著藥物預(yù)處理研究的不斷深入，研究者發(fā)現(xiàn)，線粒體是多類藥物作用的靶點(diǎn)，MPTP與mitoKATP通道在預(yù)處理中起著重要作用。

筆者前期對吸入麻醉藥異氟烷預(yù)處理在鼠腦缺血再灌注損傷中線粒體介導(dǎo)的保護(hù)作用研究中發(fā)現(xiàn)，此保護(hù)作用與抑制MPTP、降低線粒體Ca2+超載有關(guān)［1］。而肝組織含有大量MPTP，其是否參與吸入麻醉藥異氟烷對肝缺血再灌注損傷的保護(hù)作用尚不清楚。本研究通過對大鼠肝缺血再灌注損傷后MPTP及線粒體Ca2+濃度的檢測，旨在探討麻醉藥異氟烷預(yù)處理在肝部分缺血再灌注損傷中的作用及線粒體介導(dǎo)的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物選擇及分組 健康雄性SD大鼠75只，體質(zhì)量280～350 g，由我院動(dòng)物部提供，每組15只。隨機(jī)分假手術(shù)組(S組)，缺血再灌注組(I/R組)，異氟烷預(yù)處理組(ISO組)，環(huán)胞菌素A(CsA，MPTP特異性阻滯藥)+ISO組和CsA組。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 肝缺血再灌注模型的制作 建立大鼠肝缺血再灌注模型，10%水合氯醛(0.35 g/kg)腹腔注射麻醉，采用腹腔弧形切口，充分顯露第一肝門，入腹后分離肝十二指腸韌帶，分離膽總管，應(yīng)用無創(chuàng)動(dòng)脈夾阻斷肝左葉及后葉血流，造成70%肝臟缺血，但不阻斷肝右葉血流，以防門靜脈和胃腸道瘀血，60 min后松開動(dòng)脈夾，再灌注120 min。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程利用燈泡加熱，使直腸溫保持在36.7～37.3℃。

1.2.2 異氟烷預(yù)處理 將鼠置于100 cm×100 cm×100 cm的實(shí)驗(yàn)艙里，使ISO濃度維持在1.2% ～1.5%，經(jīng)進(jìn)氣孔吹入氧氣，氧濃度維持在不低于21%(Datex氣體監(jiān)測儀監(jiān)測)。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)操作 S組:入腹后只分離肝十二指腸韌帶，但不阻斷肝門血供;I/R組:肝臟缺血60 min，再灌注 120 min;ISO組:肝臟 I/R前60 min ISO(雅培公司)預(yù)處理30 min，之后在空氣中洗脫30 min。CsA+ISO組:CsA(sigma公司)50 mg/kg腹腔內(nèi)注射，30 min后同 ISO組。CsA組:I/R前30 min CsA 50 mg/kg腹腔內(nèi)注射。

1.2.4 取材及檢測 各組大鼠于再灌注2 h后迅速斷頭處死，摘取肝組織置于冰塊上，并用冰生理鹽水沖洗，部分肝組織于液氮中保存，分離線粒體進(jìn)行線粒體游離鈣、MPTP含量檢測。

(1)線粒體懸浮液的制備:低溫差異法分離線粒體，用分離介質(zhì)制成懸浮液。取組織塊(0.5 g)在冰冷的生理鹽水中沖洗，除去血液，濾紙吸干，稱重，放入小燒杯中;用移液管取預(yù)冷的分離介質(zhì)(0.01 mol/L 蔗糖、0.000 1 mol/L EDTA-2Na、0.01 mol/L Tris-Hcl、0.8%NaCL，pH=7.4)，體積總量是組織塊重量的9倍，放入小燒杯內(nèi)，用眼科小剪盡快剪碎組織塊，用組織搗碎機(jī)以約10 000 r/min研磨制成10%組織勻漿;取10%組織勻漿用低溫低速離心機(jī)以1 500 r/min離心10 min，棄沉淀，取上清液以10 000 r/min低溫高速離心機(jī)離心15 min，沉淀物為線粒體，線粒體用以上介質(zhì)制成懸浮液。取該懸浮液少許，用中性紅-詹納斯綠B染色后，在高倍顯微鏡下觀察，被染成亮綠色顆粒，即線粒體。整個(gè)過程均在0～4℃中進(jìn)行。

(2)線粒體 Ca2+濃度的測定:根據(jù) Mccormack［2］的方法改進(jìn)，以 Fura-2/AM 為 Ca2+熒光指示劑，用日本850型日立熒光分光光度計(jì)測定線粒體Ca2+濃度，發(fā)射波長510 nm，以430 nm激發(fā)光譜掃描。根據(jù)實(shí)測熒光值(F)、最大(Fmax)及最小(Fmin)熒光強(qiáng)度比值計(jì)算出Ca2+濃度，［Ca2+］i=Kd{(F-Fmin)/(Fmax-F)}，Kd為熒光指示劑的介電常數(shù)，F(xiàn)ura-2=224 nmol/L，單位為 nmol/(mg·L)。

(3)MPTP的測定:利用MPTP增大時(shí)線粒體膜內(nèi)外滲透失衡，導(dǎo)致吸光度明顯減少的原理，用1601型紫外分光光度計(jì)(島津公司，日本)，反應(yīng)條件為25℃、pH=7.4，線粒體蛋白濃度為0.5 mg/mL。反應(yīng)體系加入150 μmol/L的 Ca2+為激發(fā)劑，在540 nm波長處每分鐘記錄吸光度的變化，做吸光度的時(shí)間變化曲線，以達(dá)到平衡后的吸光度變化△S反映 MPTP開放的程度?！鱏越小，代表MPTP已經(jīng)開放的程度越大。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析 所有數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，以±s表示，組內(nèi)和組間比較均采用單因素方差分析和配對t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 線粒體游離Ca2+濃度的變化 I/R組線粒體游離Ca2+濃度明顯高于S組和ISO組(P＜0.01);ISO組Ca2+濃度高于S組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);而CsA+ISO組線粒體游離Ca2+濃度明顯高于ISO組(P＜0.01);CsA組與I/R組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明I/R后，肝臟組織線粒體Ca2+含量明顯增加，ISO預(yù)處理可以抑制其升高，而這種作用在預(yù)先用MPTP特異性阻滯藥CsA后被取消，見表1。

2.2 MPTP開放程度(ΔS)的變化 與 S組和ISO組相比，I/R組的ΔS明顯降低(P＜0.01)，I/R組與CsA組和CsA+ISO組ΔS之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與ISO組相比，CsA+ISO組的ΔS值明顯降低(P＜0.01)，見表1。

表1 各組肝臟線粒體Ca2+濃度和ΔS值的變化(±s)

表1 各組肝臟線粒體Ca2+濃度和ΔS值的變化(±s)

注:*與S組比較，P＜0.05;#與I/R組比較，P＜0.05;▲與ISO組比較，P＜0.05

組別 例數(shù) Ca2+［nmol/(mg·L)］ΔS值S組15 119.07±9.22 2.47±0.29 I/R組 15 157.01±6.63* 1.42±0.11*ISO組 15 122.27±6.67# 2.10±0.25#CsA+ISO組 15 153.48±6.24＊▲ 1.50±0.28＊▲CsA組 15 144.70±10.60* 1.62±0.22*

3 討論

研究認(rèn)為，導(dǎo)致細(xì)胞不可逆損傷的根本原因是線粒體Ca2+超載，線粒體是細(xì)胞內(nèi)最大的鈣池之一，且成為細(xì)胞存亡的控制中心［3］。Ca2+又是MPTP開放的主要誘發(fā)因子，過量的Ca2+超過線粒體自身的承受限度時(shí)，則促使MPTP開放，使線粒體基質(zhì)代謝物喪失，膜電勢消失，ATP耗竭，線粒體腫脹，造成細(xì)胞損傷。MPTP是反映線粒體膜完整及其功能的重要指標(biāo)，是一種由線粒體內(nèi)膜和外膜跨膜蛋白共同構(gòu)成的高電導(dǎo)非選擇性通道［4］，是一個(gè)至少由電壓依賴性陰離子通道(Voltage-dependentanion channel，VDAC)、腺嘌呤核苷酸移位酶(Adenine nucleotide translocase，ANT)、F1F0 ATP合酶(F1F0 ATP synthase)、親環(huán)蛋白D(Cyclophilin D，CypD)、環(huán)孢菌素 A(Cycloporin A，CsA)受體組成的多蛋白復(fù)合體。正常情況下，MPTP復(fù)合體僅允許相對分子量小于1.5×103的化合物通過，因此，其有維持線粒體基質(zhì)和細(xì)胞胞質(zhì)之間滲透壓梯度的作用［4-5］。有研究發(fā)現(xiàn)，MPTP是缺血再灌注所致肝臟細(xì)胞損傷的關(guān)鍵部位，伴隨著鈣超載而發(fā)生的氧化應(yīng)激，ATP的消耗及氧化磷酸化水平的提高，可以誘導(dǎo)線粒體內(nèi)膜上的 MPTP形成，從而改變線粒體的通透性。MPTP開放以后，由于氧化磷酸化的解耦聯(lián)及ATP的水解，導(dǎo)致線粒體功能障礙，最終導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡或者死亡［5］。所以，減少線粒體Ca2+超載，抑制MPTP的開放，維持線粒體形態(tài)及功能正常，可能防止肝細(xì)胞死亡，起到肝保護(hù)作用。

肝臟 I/R損傷的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，其中Ca2+超載和MPTP開放是一個(gè)重要的原因［6-8］。在生理狀態(tài)下，Ca2+作為細(xì)胞內(nèi)第2信使，在維持細(xì)胞增殖、分裂、能量代謝、氧代謝方面發(fā)揮著重要作用。肝細(xì)胞Ca2+濃度約為0.2 μmol/L，細(xì)胞外液Ca2+濃度約為1.3 mmol/L，即肝細(xì)胞始終處于胞內(nèi)1萬倍濃度梯度的內(nèi)環(huán)境中。細(xì)胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)定的維持對于生命活動(dòng)是至關(guān)重要的。本實(shí)驗(yàn)中，I/R組大鼠肝臟線粒體游離Ca2+濃度明顯增加，表明肝臟缺血60 min，再灌注120 min后，對肝臟產(chǎn)生了明顯的損傷;肝臟I/R時(shí)，細(xì)胞ATP減少，線粒體功能失常及細(xì)胞膜通透性增加，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣超載，從而激活磷脂酶C和磷脂酶A2，導(dǎo)致膜性結(jié)構(gòu)的破壞;激活鈣依賴蛋白酶，破壞細(xì)胞骨架與胞膜聯(lián)接的完整性而導(dǎo)致細(xì)胞損傷［9-10］;線粒體鈣超載對細(xì)胞產(chǎn)生的損傷是不可逆的。而I/R前給大鼠吸入麻醉藥ISO進(jìn)行預(yù)處理后，線粒體游離Ca2+濃度明顯降低，防止了線粒體Ca2+超載，起到了一定程度的肝臟保護(hù)作用;另外，利用MPTP增大時(shí)線粒體膜內(nèi)外滲透失衡，導(dǎo)致吸光度明顯減少的原理，檢測了各組MPTP開放程度，發(fā)現(xiàn)大鼠I/R后，肝臟線粒體MPTP大量開放，這可能是線粒體自身調(diào)節(jié)Ca2+穩(wěn)態(tài)的不良后果，而Ca2+濃度增加又可誘發(fā)MPTP開放，產(chǎn)生正反饋的惡性循環(huán);而進(jìn)行ISO預(yù)處理后，大鼠的MPTP開放受到明顯抑制，使線粒體游離Ca2+濃度降低，而Ca2+濃度降低又可抑制MPTP的開放，因此，減輕了I/R對大鼠肝臟的損傷，表明ISO預(yù)處理作用可能是通過抑制MPTP開放介導(dǎo)的。本研究設(shè)立了CsA組(藥物空白對照)，其線粒體游離Ca2+濃度和MPTP結(jié)果與I/R組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明特異性MPTP通道阻滯劑CsA本身對大鼠肝臟損傷沒有作用;同時(shí)，對鼠進(jìn)行ISO預(yù)處理前，采用特異性阻滯藥CsA腹腔注射干預(yù)后，發(fā)現(xiàn)線粒體游離Ca2+濃度明顯增加，MPTP大量開放，逆轉(zhuǎn)了ISO預(yù)處理使線粒體游離Ca2+濃度降低及抑制MPTP開放作用，取消了ISO預(yù)處理的肝臟保護(hù)作用，進(jìn)一步證明ISO預(yù)處理作用機(jī)制可能與抑制MPTP開放有關(guān)。

近年來，吸入麻醉藥預(yù)處理和后處理作用一直是麻醉學(xué)研究熱點(diǎn)之一，而其作用機(jī)制也不斷有新的發(fā)現(xiàn)［11-13］。有研究表明，異氟烷后處理作用也可能與抑制MPTP、減少線粒體Ca2+超載有關(guān)。還有研究認(rèn)為，caspase-3的活化及 metallothioneins-Ⅰ/Ⅱ起到了重要作用［14-15］。該研究結(jié)果表明，異氟烷預(yù)處理對肝臟缺血再灌注損傷具有一定程度的保護(hù)作用，這種作用可能與抑制MPTP開放、防止了線粒體Ca2+超載有關(guān)。筆者前期研究表明，ISO預(yù)處理對沙士鼠腦I/R損傷的保護(hù)作用可能是通過激活mitoKATP通道，使抗凋亡基因Bcl-2結(jié)合到線粒體膜上的量增加，同時(shí)阻止促凋亡基因Bax轉(zhuǎn)錄到線粒體膜上，從而抑制了MPTP的大量開放，發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用。異氟烷預(yù)處理對肝臟缺血再灌注損傷的保護(hù)作用是否也通過上調(diào)抗凋亡基因Bcl-2，同時(shí)防止Bax轉(zhuǎn)錄到線粒體，通過調(diào)節(jié)線粒體膜電位的的變化，影響MPTP，進(jìn)而改變線粒體蛋白的釋放，阻斷凋亡途徑，發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用，還有待于進(jìn)一步研究探討。

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