王 強(qiáng)，王心童，王虹蛟*，孟威宏，顏煒群，任立群

0 引言

關(guān)于肝纖維化機(jī)制及防治研究，目前是國(guó)內(nèi)外生物學(xué)、醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)之一［1-6］。目前，尚未見(jiàn)到有關(guān)抑肽酶對(duì)實(shí)驗(yàn)性慢性肝損傷肝組織超微結(jié)構(gòu)改變的研究報(bào)道。本研究利用四氯化碳(CCl4)建立Wister大鼠慢性肝損傷模型，同時(shí)給予抑肽酶，觀察其對(duì)慢性肝損傷肝組織超微結(jié)構(gòu)改變的保護(hù)作用，并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 Wister大鼠，雌雄兼用，由長(zhǎng)春高新醫(yī)學(xué)動(dòng)物研究中心提供，合格證號(hào):醫(yī)動(dòng)字第1055118。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 大鼠慢性CCl4肝損傷模型的建立 Wister大鼠，體重190～210 g，雌雄各半，由高新實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心供應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)采用新鮮的花生油作為溶劑。將25%CCl4溶解于花生油中混勻。正常對(duì)照組僅皮下注射花生油5 mL/kg，其他各組大鼠首次給予CCl4原液5 mL/kg，以后每周2次25%CCl4液(花生油稀釋)5 mL/kg皮下注射。禁食，不禁水。

1.2.2 動(dòng)物分組及給藥 (1)第1組為正常對(duì)照組:腹腔注射等量生理鹽水。(2)第2組為慢性肝損傷模型組:腹腔注射等量生理鹽水。(3)第3組為抑肽酶小劑量組:腹腔注射抑肽酶2萬(wàn)KIU/kg。(4)第4組為抑肽酶中劑量組:腹腔注射抑肽酶4萬(wàn)KIU/kg。(5)第5組為抑肽酶大劑量組:腹腔注射抑肽酶8萬(wàn)KIU/kg。(6)第6組為促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素注射液組(陽(yáng)性組):腹腔注射促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素100 mg/kg。3～5組每天給予抑肽酶一次，連用4周，第6組每天給予促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素1次，連用4周。禁食，不禁水。

1.2.3 肝組織切片制作 固定在4%戊二醛中的肝臟，經(jīng)過(guò)戊二醛-鋨酸雙重固定，梯度乙醇、丙酮系列脫水，環(huán)氧樹(shù)脂包埋，半薄切片定位，超薄切片，醋酸雙氧鈾-檸檬酸鉛雙重染色，透射電鏡下觀察其超微結(jié)構(gòu)改變。

2 結(jié)果

空白對(duì)照組肝細(xì)胞體積較大，肝細(xì)胞面可見(jiàn)細(xì)胞連接結(jié)構(gòu)，膽小管兩端緊密連接的結(jié)構(gòu)清晰;腔面可見(jiàn)較多微絨毛，肝血竇面微絨毛較多。肝細(xì)胞核呈圓形，核仁明顯，核內(nèi)常染色質(zhì)多。胞質(zhì)內(nèi)線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)豐富，可見(jiàn)糖原顆粒和少量溶酶體(圖1)。

圖1 空白對(duì)照組(TEM bar=500 nm)

四氯化碳模型組肝細(xì)胞呈腫脹狀，細(xì)胞界限不清，膽小管兩端緊密連接消失;腔面微絨毛減少。肝細(xì)胞核呈圓形固縮狀;核內(nèi)異染色質(zhì)凝聚、趨邊;核基質(zhì)空化。胞質(zhì)內(nèi)基質(zhì)局部空化，細(xì)胞器呈絮狀或消失，部分線粒體外膜結(jié)構(gòu)模糊，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)數(shù)量減少且呈散在分布(圖2)。

圖2 四氯化碳模型組(TEM bar=1μm)

抑肽酶小劑量組肝細(xì)胞體積大小不一，個(gè)別細(xì)胞呈固縮狀。膽小管輕度擴(kuò)張;小管兩端連接結(jié)構(gòu)清晰;腔面微絨毛減少，并可見(jiàn)髓樣小體。肝細(xì)胞核呈圓形，少量異染色質(zhì)呈塊狀。胞質(zhì)內(nèi)線粒體呈堆分布;粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)較少;部分細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)較多絮狀結(jié)構(gòu)、少量脂滴及線粒體腫脹、嵴斷裂(圖3)。

圖3 促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素組(TEM bar=1 μm)

抑肽酶中劑量組肝細(xì)胞體積稍大;膽小管兩端緊密連接結(jié)構(gòu)清楚;腔面微絨毛較多。核呈圓形，核仁明顯，可見(jiàn)少量塊狀的異染色質(zhì)。胞質(zhì)內(nèi)線粒體數(shù)量多;粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)較多且平行排列，呈堆分布;可見(jiàn)大量糖原聚集，偶見(jiàn)脂褐素顆粒(圖4)。

抑肽酶大劑量組肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)接近空白對(duì)照組，細(xì)胞體積較大，細(xì)胞界限清楚;膽小管結(jié)構(gòu)正常。肝細(xì)胞核較大，呈圓形，核膜清晰;核內(nèi)常染色質(zhì)多，可見(jiàn)少量小塊狀的異染色質(zhì);核仁多個(gè)。胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)大量線粒體;粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)豐富，呈平行排列;可見(jiàn)少量糖原顆粒(圖5)。

圖4 抑肽酶小劑量組(TEM bar=1 μm)

圖5 抑肽酶中劑量組(TEM bar=1 μm)

促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素組肝細(xì)胞體積大小不等，細(xì)胞界限可辨;膽小管腔面微絨毛較多。細(xì)胞核呈圓形，核仁1個(gè)，呈圓形。胞質(zhì)內(nèi)線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)較多，可見(jiàn)少量糖原顆粒，偶見(jiàn)呈絮狀的細(xì)胞器結(jié)構(gòu)(圖6)。

3 討論

圖6 抑肽酶大劑量組

肝纖維化是肝硬化病變發(fā)展過(guò)程中的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，肝纖維化的發(fā)生機(jī)制是復(fù)雜的病理過(guò)程，肝細(xì)胞外基質(zhì)的合成與降解處于動(dòng)態(tài)失衡，即細(xì)胞外基質(zhì)的合成增多或者降解減少可致細(xì)胞外基質(zhì)沉積，最終誘發(fā)肝纖維化的形成。早期的纖維化是可逆的，但到后期有再生結(jié)節(jié)形成時(shí)則不可逆。肝纖維化的高危因素有腎素、血管緊張素系統(tǒng)(Reninangiotensin system，RAS)、基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinase，MMPS)、血小板源性生長(zhǎng)因子(Plateletderived growth factor，PDGF)和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng) 因 子 β (Transforming growth factor-beta，TGFβ)。除此之外，肝硬化的一些病因也是肝纖維化的致病因素，如病毒性肝炎、酒精中毒、高半胱氨酸血癥、毒物和一些藥物等。肝臟疾病已經(jīng)被確定為世界健康問(wèn)題中重要之一，很多因素可以導(dǎo)致肝臟病毒感染，包括藥物和毒物，肝缺血再灌注。CCl4是一種傳統(tǒng)的肝毒素，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中被廣泛用于誘導(dǎo)肝臟損傷，通過(guò)阻斷或延緩炎癥反應(yīng)過(guò)程和凋亡從而阻止或治療。氧化應(yīng)激反應(yīng)在CCl4誘導(dǎo)肝毒性損傷發(fā)揮重要的作用。大量研究表明，CCl4主要用于肝損傷，因?yàn)槠渲饕x高活性三氯甲基自由基。CCl4誘導(dǎo)肝毒性損傷的另一個(gè)重要的病理機(jī)制是炎癥反應(yīng)。已有報(bào)道在CCl4誘導(dǎo)急性肝毒性損傷中觀察到嚴(yán)重的肝細(xì)胞凋亡反應(yīng)［7-14］。抑肽酶是一種有效的抗纖維蛋白溶解酶，其可以抑制多種絲氨酸蛋白酶，特別是血纖維蛋白溶酶、胰蛋白酶、凝乳蛋白酶、凝血酶和激肽釋放酶，除此之外，其還可以單獨(dú)抑制纖維蛋白溶解，具有抗炎作用，能降低白細(xì)胞激活作用和抑制細(xì)胞因子釋放。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，這種抑制炎性反應(yīng)甚至可以提高神經(jīng)反應(yīng)，但此結(jié)果在人體研究中未得到證實(shí)。而且人類研究結(jié)果表明，其可能會(huì)降低中風(fēng)發(fā)生率。廣譜抑肽酶在多個(gè)絲氨酸蛋白酶凝固和溶解纖維蛋白方面被認(rèn)為是賴氨酸類似物。抑肽酶于1993年在美國(guó)被FDA首次批準(zhǔn)使用，用在冠狀動(dòng)脈旁路移植中減少失血作用。德國(guó)批注其為抑肽酶，在心臟和非心臟手術(shù)中有著非常重要的減少出血的作用［15-18］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，抑肽酶對(duì)大鼠慢性CCl4肝損傷模型具有很好的保護(hù)性作用，能明顯減輕慢性肝損傷的程度，抑制肝纖維化的發(fā)展。其作用機(jī)制還不清楚，但從本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果可以認(rèn)為，是從減輕肝細(xì)胞的損傷及抑制肝纖維化的發(fā)展兩個(gè)方面對(duì)慢性肝損傷起到保護(hù)性作用。

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