崔貞玉，韓素霞 ，董曉光，馮 磊，常建梅，郭李平

0 引言

心肌梗死后大量心肌細胞的肥大、死亡和纖維細胞的生成導致心肌重塑的形成，包括早期的梗塞膨脹、非梗死區(qū)反應性肥厚和晚期球形心室擴張［1-2］。心肌重塑能導致左室擴張、心功能異常與死亡，嚴重損害了心梗后的心功能。因此如何預防和減輕心肌梗死后的心肌重塑成為臨床醫(yī)師迫切解決的問題。心肌梗死后的心肌重塑與RAS系統(tǒng)的激活相關［3］。有研究表明，心肌梗死不僅能激活循環(huán)RAS，其心肌梗死模型組心肌AngⅡ表達量亦明顯高于假手術組組，提示心肌梗死同時導致了心肌局部RAS系統(tǒng)的激活［4］。眾所周知，RAS系統(tǒng)中起著升壓、損害心功能等的關鍵作用因子是AngⅡ［5-6］。而 ACE2自2000年被發(fā)現(xiàn)以來，其主要的生物學效應就是降解AngⅡ生成Ang1-7［7］。Ang-(1-7)作用于其受體 MAS，有降低血壓、減輕心肌纖維化等拮抗 AngⅡ的作用［8-9］。因此我們推測，ACE2對調(diào)節(jié)心肌梗死后的心肌重塑的作用也非常關鍵。

1 材料與方法

1.1 動物模型的建立 (200±20)g雄性SD大鼠32只(購于新疆醫(yī)科大學實驗動物研究中心，SPF級。倫審號:IACUC-20121127010)，采用隨機數(shù)字表法將大鼠隨機分為假手術組、MI組、MI+氯沙坦小劑量組和MI+氯沙坦大劑量組，每組各8只。術前禁食12 h。腹腔內(nèi)麻醉后固定，記錄心電圖。經(jīng)口腔行氣管插管，接呼吸機。無菌條件下消毒切口，在左側2、3肋間開胸，于左心耳右下緣1 mm、肺動脈圓錐左緣處用6號帶針縫線結扎冠狀動脈前降支，心電圖顯示QRS波增寬增高及不同肢體導聯(lián)出現(xiàn)ST段弓背向上抬0.2 mV以上，肉眼下觀察結扎后梗死區(qū)變蒼白，則提示結扎成功。結扎成功后關胸。假手術組在心臟相應部位掛線，但不結扎。術后24 h內(nèi)給予嗎啡肌注鎮(zhèn)痛，6 h/1次;術后3 d連續(xù)給予青霉素肌注預防感染，1次/d。于術后24 h開始灌胃給藥，給藥期1個月。假手術組和MI組給予蒸餾水等量灌胃，MI+氯沙坦小劑量組給予替米沙坦10 mg/(kg·d)，MI+氯沙坦大劑量組給予替米沙坦20 mg/(kg·d)。

1.2 取材 將大鼠腹腔內(nèi)麻醉后腹主動脈放血致死，在心臟還未停止跳動時快速取下心尖部心臟，將組織縱剖為二，分別置于液氮和4%多聚甲醛中保存。

1.3 心肌組織病理學觀察 組織于4%多聚甲醛中固定，24 h換一次液，48 h后石蠟包埋切片，按蘇木素-伊紅(HE)染色程序染色，光鏡下觀察心肌組織梗死后心肌細胞腫脹、壞死和炎癥細胞浸潤情況。

1.4 定量逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR) 用Trizol試劑盒(roche公司，瑞士)按說明書抽提心肌組織總RNA，逆轉錄試劑盒(roche公司，瑞士)將1 μg RNA按其說明書逆轉錄為cDNA，最后以cDNA為模板進行PCR擴增。引物設計參考文獻，由上海生工公司合成并純化，ACE2引物:上游5'-GTGGAGCACTGACTGGAGC-3'，下 游 5'-GACAGGAGGCTCGTAAGGTG-3'，擴增片段長:403 bp;AngⅡ 引物:上游 5'-TTGGGTGCTGAGGCAAATCT-3'， 下 游 5'-TTGGGTGCTGAGGCAAATCT-3'，擴增片段長:244 bp;MAS引物:上游 5'-TGACAGCCATCAGTGTGGAGA-3'，下游5'-GCATGAAAGTGCCCACAGGA-3'，擴 增 片 段長度:116;β-actin引物:上游 5'-CCCTGTGCTGCTCACCGA-3'，下游 5'-ACAGTGTGGGTGACCCCGTC-3'，擴增片段長度:186 bp。MAS和 βactin的反應體系為40 μL，AngⅡ和ACE2的反應體系為25 μL。目的基因的擴增條件:95℃下預變性5 min后，95℃變性30 s，最適退火溫度30 s，72℃延伸30 s，35個循環(huán)后，72℃延伸7 min。其中MAS、AngⅡ、ACE2的退火溫度分別為59.5、60、55℃。β-actin的退火溫度 57 ℃。取 5 μL PCR產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠85 V電泳30 min。凝膠用全能型凝膠成像分析儀(Bio-Rad公司，美國)攝像，錄入計算機，用凝膠成像分析系統(tǒng)分析電泳條帶的面積和平均灰度，計算樣本的灰度值(面積×平均灰度)，以各組β-actin灰度值為內(nèi)參照，計算各指標的mRNA的相對表達量(相對灰度%)。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用Excel軟件及SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行處理。數(shù)據(jù)采用±s表示，兩組間比較采用t檢驗。多組間差異采用方差分析。多組間兩兩比較采用q檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 ECG結果 結扎左冠狀動脈前降支前，心電圖顯示為正常心電圖，心率145次/min;結扎后心電圖結果顯示:心率202次/min，ST段抬高，T波高尖，為典型心肌梗死心電圖波形，提示心肌梗死模型建造成功。見圖1。

2.2 病理形態(tài)觀察 HE染色顯示MI組梗死區(qū)心肌細胞腫脹、變形、破裂、排列雜亂，細胞質(zhì)流入細胞間隙，幾乎沒有明顯的殘存心肌細胞，細胞間質(zhì)增生，炎癥細胞浸潤明顯;氯沙坦大劑量組心肌細胞壞死少見，細胞腫脹減輕，心肌纖維排列紊亂，部分肌纖維斷裂，伴少量炎性細胞浸潤;氯沙坦小劑量組居中;假手術組心肌纖維排列規(guī)則，無病理改變。見圖2。

2.3 RT-PCR結果

2.3.1 ACE2的RT-PCR結果 MI組心尖部心肌組織的表達量高于假手術組(P＜0.05)。替米沙坦大劑量組和小劑量組的表達量均高于MI組，且大劑量組升高更顯著(P＜0.05)。

2.3.2 AngⅡ的RT-PCR結果 MI組心尖部心肌組織的表達量明顯高于假手術組(P＜0.05)。替米沙坦大劑量組和小劑量組的表達量均低于MI組，且大劑量組降低更顯著(P＜0.05)。

圖3 各組大鼠ACE2的RT-PCR電泳結果

3 討論

本研究結果發(fā)現(xiàn)，心肌梗死后心尖部梗死區(qū)心肌組織中AngⅡ表達量明顯增加，氯沙坦組呈劑量依賴性下降。心室重構程度跟AngⅡ表達量呈正相關。ACE2在MI組變化不明顯或代償性地輕微增加，氯沙坦組呈劑量依賴性繼續(xù)增加。本研究旨在通過氯沙坦的藥物作用來使得藥物組ACE2表達量增加，以便觀察不同劑量ACE2對AngⅡ表達量的影響。結果發(fā)現(xiàn)，藥物組ACE2表達量越高，AngⅡ表達量越少，病理染色觀察其心肌細胞腫脹和壞死也隨之明顯減輕。說明ACE2可抑制AngⅡ表達量，減輕心室重構，保護殘存心功能。

ACE2與Ang-(1-7)及其受體MAS一起組成與傳統(tǒng) ACE-AngⅡ-AT1相拮抗的保護性 RAS軸:ACE2-Ang-(1-7)-MAS 受體軸［10］。該軸發(fā)揮降壓、抗炎、抗纖維化和抗增殖等重要作用。ACE的同源物ACE2自發(fā)現(xiàn)以來，就被證實通過降解AngⅡ和生成Ang-(1-7)來發(fā)揮作用，也是心肌組織中 AngⅡ降解和 Ang-(1-7)生成的主要途徑［7-11］。Averill等［12］研究證實，Ang-(1-7)在心臟的表達局限在心肌細胞內(nèi)，梗死的心肌細胞無Ang-(1-7)表達，梗死周邊區(qū)域Ang-(1-7)表達明顯增強，提示 Ang-(1-7)與心肌重構有關，而ACE2是降解 AngⅡ生成Ang-(1-7)的關鍵酶。Gurzu 等［13］發(fā)現(xiàn)，Ang-(1-7)可抑制 AngⅡ誘導的血管收縮，表明Ang-(1-7)可與AT1受體結合發(fā)揮作用。心肌梗死后機體通過代償機制上調(diào)ACE2的表達，既能降解過度增高的AngⅡ，減輕其對心肌的毒性作用，又能催化生成對心肌有保護作用的Ang-(1-7)，進一步拮抗AngⅡ的表達，抑制和逆轉心肌重構，對衰竭心臟有保護效應［14］，從而對心肌梗死后受損的心肌產(chǎn)生雙重的保護作用，延緩心功能惡化。

目前ACE2軸是心血管領域的研究熱點，相關研究已經(jīng)取得了一定的成果。其中較有意義的一項實驗證實敲除ACE2基因后的小鼠出現(xiàn)左室變薄、心功能減退等表現(xiàn)，再敲除ACE基因后原本受損的心功能恢復正常，證實ACE和ACE2的負向調(diào)節(jié)作用及其表達的穩(wěn)態(tài)對維持正常心功能的重要性［15］。心肌梗死大鼠心肌組織中AngⅡ和ACE2的mRNA表達量均較假手術組升高，進一步證實了心肌梗死后心臟局部RAS系統(tǒng)的激活。根據(jù)以往研究推測MI組ACE2升高是由心肌梗死后慢性長期的組織修復導致［16］。其他原因如:血流動力學紊亂、心肌重構等慢性刺激因素，具體的機制尚不清楚。但心肌梗死后心肌組織中ACE2的表達量增加，ACE/ACE2比值卻升高，表明梗死激活ACE的程度遠遠大于ACE2，ACE2已經(jīng)不能對抗過度激活的ACE，大量AngⅡ生成，發(fā)揮其促炎癥、增殖、纖維化等心臟毒性效應［17］。

因此我們推測，AngⅡ在藥物組表達的減少可能依賴3方面因素:①藥物抑制心肌梗死后AT1受體上調(diào)，阻斷了AngⅡ與其主要作用受體AT1的結合，進一步拮抗了AngⅡ的生成［18］。②ACE2表達量的增加使AngⅡ降解增加，將其降解為Ang-(1-7)，從而作用于MAS受體發(fā)揮降壓、抗纖維化等保護作用。③ACE2的增加使AngⅡ的降解產(chǎn)物Ang-(1-7)增加，反作用于AT1受體，拮抗其功能，從而抑制 AngⅡ的表達［19-20］。

本實驗的研究結果與以往研究結果基本一致。進一步證實了心肌梗死后RAS系統(tǒng)的激活對心室重構的影響，也明確了ACE2通過減少AngⅡ的表達來抑制心肌梗死后心室重塑的作用機制，為臨床治療心室重塑提供了更深一步的參考方案，為心肌梗死預后心功能的改善提供了更多的可能性。

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