于 巍，林立紅，王 剛，孫常松，孟慶賀，李曉磊，段明郁

（1.沈陽化工研究院安全評價中心，遼寧 沈陽110021；2.沈陽科創(chuàng)化學(xué)品有限公司，遼寧 沈陽110144）

吡蚜酮化學(xué)名4，5－二氫－6－甲基－4－（3－吡啶亞甲基氨基）－1，2，4－3（2 H）－酮，屬非殺傷性新型殺蟲劑，具有高效、低毒、高選擇性、對環(huán)境生態(tài)安全等特點，主要通過食物鏈途徑進入人體[1］。目前已報道的吡蚜酮檢測方法包括高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[2－3］、氣相色譜－質(zhì)譜法等[4－5］，多用來檢測煙草、煙堿、水果及蔬菜中的殘留量[6－7］，但用于檢測動物體內(nèi)血漿藥物濃度尚未見報道。作者在此采用液質(zhì)聯(lián)用儀檢測不同染毒劑量下SD大鼠血漿中吡蚜酮的濃度，并研究其在大鼠體內(nèi)的毒代動力學(xué)過程，擬為進一步的深入研究提供依據(jù)。

1 實驗

1.1 試驗動物、試劑與儀器

SPF級SD雄性大鼠（質(zhì)量合格證號：211002300000434）11只，體重250～300g，遼寧長生生物技術(shù)有限公司。實驗前禁食18h。

吡蚜酮原藥（純度98.0%），沈陽科創(chuàng)化學(xué)品有限公司；吡蚜酮標準品（純度99.5%），沈陽化工研究院有限公司農(nóng)標室；乙腈（色譜純），F(xiàn)isher公司；50%甲酸（色譜純），F(xiàn)luka公司；CO2（麻醉用）；玉米油（金龍魚牌非轉(zhuǎn)基因油）。

LC－20A／AB API3200 型 液 質(zhì) 聯(lián) 用 儀 （LC－MS／MS），配備 Analyst1.5.1軟件，島津公司；T18型勻漿機，IKA公司；Sartorius BP211D型電子天平（十萬分之一）；3K15型高速離心機，Sigma公司；移液器，Eppendorf公司。

DAS Ver2.0軟件，上海中醫(yī)藥大學(xué)藥物臨床研究中心編制。

1.2 方法

1.2.1 測試條件

色譜柱為 Phenomenex Luna C18（50mm×4.6 mm，5μm）；流動相為水－乙腈（含0.1%甲酸），梯度洗脫程序：水－乙腈（95∶5，體積比，下同），0.5min；水－乙腈（5∶95），2.0min；水－乙腈（95∶5），3.1min；水－乙腈（95∶5），5.0min；流速0.6mL·min－1；柱溫為室溫；進樣量10μL；保留時間2.3min。

離子源為ESI源；離子源溫度500℃；噴霧電壓5 000V；CAD值3.00；EP值4.00V；CEP值15.91；GAS1值50.00；GAS2值55.00；氣簾氣值25.00；檢測方式為 MRM；定量離子對為218.30／105.30；DP值100.00V；CE值30.00；CXP值10.00。

1.2.2 溶液的配制

標準曲線工作溶液：精確稱量吡蚜酮標準品，用乙腈配制成1.00g·L－1的吡蚜酮母液，并稀釋成濃度（mg·L－1）為 1.00、2.00、4.00、8.00、20.0、80.0、160、200的梯度溶液。

質(zhì)控樣品工作溶液：用乙腈將1.00g·L－1的吡蚜酮母液稀釋成濃度（mg·L－1）為4.00、40.0、160的梯度溶液。

1.2.3 血漿樣品處理

向190μL空白大鼠血漿樣品（實驗前從空白大鼠采集）中加入10μL吡蚜酮溶液，渦旋1min；取150 μL，加入300μL乙腈，渦旋混勻，置于離心機中以15 000r·min－1離心10min；取上清液100μL，加入900μL超純水稀釋后，進樣分析。

取給藥大鼠血漿樣品30μL，加入60μL乙腈，渦旋混勻，置于離心機中以15 000r·min－1離心10 min；取上清液50μL，加入450μL超純水稀釋后，進樣分析。

1.2.4 毒代動力學(xué)研究

實驗設(shè)高、低兩個劑量組，單次染毒。根據(jù)雄性大鼠急性經(jīng)口毒性LD50為5 820mg·kg－1，高劑量設(shè)定為限量劑量[8］，即1 000mg·kg－1；低劑量設(shè)定為雄性大鼠高劑量的1／10，即100mg·kg－1。

大鼠稱重，按100mg·kg－1和1 000mg·kg－1的劑量采取經(jīng)口灌胃方式，一次給足設(shè)計劑量，給藥后將大鼠放回代謝籠內(nèi)，自由進食、飲水?？瞻讓φ沼诮o藥前采集血樣，高劑量組于投藥后的10min、30min、1h、2h、4h、7h、24h、31h、48h、72h、96h，低劑量組于投藥后的10min、30min、1h、2h、4h、5.5h、7h、12h、24h，經(jīng)眼眶靜脈叢采血0.1mL至肝素處理的離心管中，混勻，以8 000r·min－1離心10min，取上層血漿，置于－70℃冰箱冷凍保存，待測。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

用DAS Ver2.0軟件對數(shù)據(jù)進行擬合，計算毒代動力學(xué)參數(shù)，包括達峰時間（tmax）、峰值濃度（cmax）、消除半衰期（t1／2β）、表觀分布容積（Vz）、體內(nèi)總清除率（CLz）、毒時曲線下面積[AUC（0～t）、AUC（0～∞）］，并進行統(tǒng)計分析。采用梯形法計算AUC、cmax與tmax均為實測值。

2 結(jié)果與討論

2.1 分析方法的方法學(xué)考察

2.1.1 特異性

分別將空白大鼠血漿樣品、空白大鼠血漿加入吡蚜酮標準品、給藥1 000mg·kg－11.0h后的大鼠血漿樣品按1.2.3方法前處理，進行LC－MS／MS分析，結(jié)果見圖1。

a.空白大鼠血漿 b.空白大鼠血漿添加吡蚜酮標準品c.給藥1 000mg·kg－11.0h后的大鼠血漿樣品

圖1 不同樣品的LC－MS／MS圖譜

Fig.1 LC－MS／MS Chromatograms of different samples

由圖1可見，血漿中內(nèi)源性雜質(zhì)對吡蚜酮的分析沒有影響，方法的特異性良好。

2.1.2 標準曲線

用空白大鼠血漿稀釋標準曲線工作溶液，配制成濃度（mg·L－1）分別為0.050、0.100、0.200、0.400、1.00、4.00、8.00、10.0的標準曲線樣品。按1.2.3方法前處理，進行LC－MS／MS分析。以吡蚜酮的峰面積（Y）對濃度（X）繪制曲線，擬合得回歸方程為Y＝aX2＋bX＋c，結(jié)果見表1 。

由表1 可知，吡蚜酮在0.050～10.0mg·L－1范圍內(nèi)相關(guān)性良好。

表1 吡蚜酮大鼠血漿標準曲線回歸方程參數(shù)Tab.1 Parameters of regression equation of pymetrozine in rat plasma

2.1.3 準確度和精密度

用空白大鼠血漿稀釋質(zhì)控樣品工作溶液，配制成考察準確度與精密度的質(zhì)控樣品（QC），吡蚜酮濃度（mg·L－1）分別為0.200、2.00和8.00，按1.2.3方法前處理，進行LC－MS／MS分析，每天配制一套標準曲線和QC樣品，平行進行3d，考察方法的準確度、批內(nèi)精密度與批間精密度，結(jié)果見表2 。

表2 吡蚜酮在大鼠血漿中的準確度、精密度和穩(wěn)定性／%Tab.2 Recovery，precision and stability of pymetrozine in rat plasma／%

由表2 可知，準確度和精密度結(jié)果符合方法學(xué)要求。

2.1.4 穩(wěn)定性

用空白大鼠血漿稀釋質(zhì)控樣品工作溶液，配制成吡蚜酮濃度（mg·L－1）分別為0.200、2.00和8.00的質(zhì)控樣品，各12份，其中6份室溫放置0h、4h、6h后按1.2.3方法前處理，進行LC－MS／MS分析，考察其室溫穩(wěn)定性；另外6份分別在－70℃冰箱保存1周、2周和4周后按1.2.3方法前處理，進行LC－MS／MS分析，考察其－70℃冰箱保存穩(wěn)定性；另外配制3種濃度的吡蚜酮血漿樣品保存于－70℃冰箱中，于24h、48h和72h取出反復(fù)凍融，按1.2.3方法前處理，進行LC－MS／MS分析，考察其凍融穩(wěn)定性，結(jié)果見表2 。

由表2 可知，各條件下吡蚜酮樣品均穩(wěn)定。

2.2 吡蚜酮在大鼠體內(nèi)的毒代動力學(xué)參數(shù)測定

大鼠經(jīng)口灌胃給予吡蚜酮后，血漿藥物濃度－時間曲線如圖2所示，經(jīng)DAS Ver2.0軟件處理，采用統(tǒng)計矩模型計算，結(jié)果見表3 。

圖2 吡蚜酮大鼠血漿藥物濃度－時間曲線Fig.2 Concentration－time curves of pymetrozine in rat plasma

由圖2可知，SD大鼠經(jīng)口灌胃給予吡蚜酮后，血漿中10min即可檢出毒物，給藥后低、高劑量組分別在4h和2h藥物濃度達峰，而后隨時間延長逐漸下降，分別在24h、48h時血漿藥物濃度均低于cmax的5%。

表3 吡蚜酮主要毒代動力學(xué)參數(shù)（n＝5）Tab.3 Toxicokinetics parameters of pymetrozine（n＝5）

由表3 可知，低、高兩個劑量組：達峰時間（tmax）分別為4h和2h；峰值濃度（cmax）分別為36 180μg·L－1和69 388μg·L－1；消除半衰期（t1／2β）分別為18.972h和33.177h，高劑量較長，提示其消除較慢，可能在體內(nèi)蓄積，且1 000mg·kg－1劑量組已基本達吸收飽和；表觀分布容積（Vz）較小，分別為2.65L·kg－1和8.236L·kg－1，說明吡蚜酮對血漿外組織親和力較弱；體內(nèi)總清除率（CLz）分別為0.107L·h－1·kg－1和0.266L·h－1·kg－1；毒 時 曲 線 下 面 積 [AUC（0～t）］分 別 為652 604.71μg·h· L－1和1 674 767.1μg·h· L－1；AUC（0～∞）分 別 為 931 164.77 μg· h· L－1和1 876 484.6μg·h· L－1。

2.3 討論

吡蚜酮為低毒農(nóng)藥，臨床未見有急性中毒的報道。本研究表明，吡蚜酮能迅速吸收進入血液，隨后快速分布，緩慢消除。經(jīng)DAS Ver2.0軟件處理數(shù)據(jù)，采用統(tǒng)計矩模型計算，得到低、高劑量組的 AUC（0～t）的比值為0.39、AUC（0～∞）的比值為0.50，提示其與給藥劑量不成比例（給藥劑量比為0.10），呈現(xiàn)出非線性代謝動力學(xué)特征。

3 結(jié)論

采用LC－MS／MS分析方法研究不同染毒劑量下吡蚜酮在SD大鼠體內(nèi)的毒代動力學(xué)特征。色譜柱為Phenomenex Luna C18（50mm×4.6mm，5μm），采用ESI離子源，定量離子對為218.30／105.30。結(jié)果表明，大鼠經(jīng)口灌胃給予吡蚜酮后，由統(tǒng)計矩參數(shù)表示的低、高兩個劑量組主要毒代動力學(xué)參數(shù)如下：達峰時間（tmax）分別為4h和2h；峰值濃度（cmax）分別為36 180 μg·L－1和69 388μg·L－1；消除半衰期（t1／2β）分別為18.972h和33.177h；表觀分布容積（Vz）分別為2.65 L·kg－1和8.236L·kg－1；體內(nèi)總清除率（CLz）分別為：0.107L·h－1·kg－1和0.266L·h－1·kg－1；毒時曲線下面積[AUC（0～t）］分別為652 604.71μg·h·L－1和1 674 767.1μg·h· L－1；AUC（0～∞）分別為931 164.77μg·h· L－1和1 876 484.6μg·h·L－1。在毒性劑量下，吡蚜酮在大鼠體內(nèi)的毒代動力學(xué)過程具有非線性動力學(xué)特征。值得注意的是，1 000 mg·kg－1劑量組消除半衰期較長，易發(fā)生蓄積。

采用LC－MS／MS進行檢測，方法準確、靈敏，可為吡蚜酮毒代動力學(xué)的深入研究提供方法學(xué)依據(jù)，進而為毒理學(xué)試驗設(shè)計奠定基礎(chǔ)。

[1]張梅鳳，于樂祥，張秀珍.高毒農(nóng)藥替代品種吡蚜酮的研究[J］.今日農(nóng)藥，2009，（6）：21－23.

[2]嚴會會，胡斌，劉惠民，等.高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法分析煙草中15種農(nóng)藥殘留[J］.煙草科技，2011，（7）：43－47.

[3]劉建華，張小峰，季美娟，等.吡蚜酮原藥高效液相色譜分析[J］.農(nóng)藥，2008，（10）：741－742.

[4]許秀瑩，施海燕，王鳴華.氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用測定大米中6種煙堿類農(nóng)藥殘留[J］.質(zhì)譜學(xué)報，2012，33（2）：99－103.

[5]華乃震.吡蚜酮國內(nèi)外進展、加工劑型和應(yīng)用[J］.農(nóng)藥市場信息，2013，（16）：4－7.

[6]胡璇，沈國清，陸貽通，等.甘藍中吡蚜酮殘留量的高效液相色譜分析[J］.農(nóng)藥，2008，47（3）：184－185，189.

[7]唐俊，朱仁杰，何成鵬，等.大米、蘋果中吡蚜酮殘留量測定[J］.中國農(nóng)學(xué)通報，2008，24（11）：109－112.