關(guān)亞鵬，婁 忻，張 莉，劉 靚，佟 杰

（1.華北制藥集團(tuán)新藥研究開發(fā)有限責(zé)任公司 微生物藥物國家工程研究中心 河北省工業(yè)微生物代謝工程技術(shù)研究中心，河北 石家莊050015；2.華北制藥集團(tuán)股份有限公司，河北 石家莊050015）

棘白霉素類抗真菌藥是一類最新型的廣譜抗真菌藥，能夠抑制真菌細(xì)胞壁的合成，對(duì)念珠菌屬和曲霉屬等引起的深部感染均有效，這類藥物抗菌譜廣、毒性低、無交叉耐藥性，對(duì)治療嚴(yán)重感染具有廣闊的應(yīng)用前景。目前已上市的該類藥物包括卡泊芬凈、米卡芬凈和阿尼芬凈[1－6］。脫?；府a(chǎn)生菌可以將米卡芬凈和阿尼芬凈的前體物質(zhì)FR901379和棘白霉素B脫去?；鶄?cè)鏈形成母核（中間體），由母核進(jìn)而合成米卡芬凈或阿尼芬凈。

作者以棘白霉素B為前體物質(zhì)，研究脫?；府a(chǎn)生菌轉(zhuǎn)化阿尼芬凈中間體的條件，首先利用紫外誘變復(fù)合Cu2＋抗性處理篩選脫?；府a(chǎn)生菌高產(chǎn)菌種，之后以均勻設(shè)計(jì)方法對(duì)高產(chǎn)菌種的轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行優(yōu)化，擬為其工業(yè)化應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 菌種與培養(yǎng)基

棘白霉素類化合物脫酰基酶產(chǎn)生菌ZH－1020，自行保存。

固體培養(yǎng)基：葡萄糖，酵母粉，復(fù)合維生素B，微量鹽。

種子培養(yǎng)基：糊精，葡萄糖，酵母粉，玉米漿，F(xiàn)eSO4·7H2O，K2HPO4·3H2O。

發(fā)酵培養(yǎng)基：酵母粉，熱榨豆餅粉，蔗糖，硫酸鎂，K2HPO4·3H2O，pH 值6.5。

1.2 搖瓶培養(yǎng)

將成熟斜面接種至種子培養(yǎng)基，于28℃、220r·min－1搖床培養(yǎng)48h后，以5%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基，于28℃、220r·min－1培養(yǎng)4d后補(bǔ)入已知濃度的底物（棘白霉素B）至培養(yǎng)基中底物終濃度為1 800μg·mL－1，繼續(xù)轉(zhuǎn)化48h。轉(zhuǎn)化結(jié)束后利用HPLC法測(cè)定發(fā)酵液效價(jià)，計(jì)算轉(zhuǎn)化率（發(fā)酵液效價(jià)與底物添加量的比率）。

1.3 菌種誘變與篩選

1.3.1 紫外誘變處理

將供試菌種斜面制得的單孢子懸液置于平板中，紫外燈（30W，254nm，36cm）下照射15s，孢子液逐級(jí)稀釋到合適濃度后涂布到固體培養(yǎng)基平板上，28℃下培養(yǎng)8d，進(jìn)行搖瓶篩選。

1.3.2 紫外誘變復(fù)合Cu2＋平板抗性處理

制備含有0.02%、0.04%、0.06%CuSO4的平板培養(yǎng)基，將紫外照射處理過的孢子液適當(dāng)稀釋后涂布于該平板上，培養(yǎng)8～10d后挑選孢子豐富、菌落相對(duì)較大的抗性菌落移至斜面，再進(jìn)行搖瓶篩選。

1.4 均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)

溫度、pH值等外界環(huán)境對(duì)轉(zhuǎn)化菌內(nèi)酶的啟動(dòng)和表達(dá)有著非常重要的影響。設(shè)定轉(zhuǎn)化溫度（℃）、發(fā)酵培養(yǎng)基pH 值、底物濃度（μg·mL－1）、轉(zhuǎn)化時(shí)間（h）為自變量X1、X2、X3和X4，相對(duì)轉(zhuǎn)化率為因變量Y1，進(jìn)行4因素3水平的均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化脫酰基酶產(chǎn)生菌的轉(zhuǎn)化條件，各因素及水平見表1 。

表1 U9（34）均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)的因素和水平Tab.1 The factors and levels of U9（34）uniform design experiment

2 結(jié)果與討論

2.1 搖瓶篩選結(jié)果（表2 ）

表2 紫外誘變復(fù)合Cu2＋抗性處理結(jié)果／%Tab.2 Results of UV irradiation combined with Cu2＋resistance selection／%

由表2 可知，紫外誘變復(fù)合Cu2＋抗性處理后的菌株死亡率較單一紫外誘變處理有了一定提高，說明此菌株對(duì)Cu2＋比較敏感，且CuSO4劑量為0.04%時(shí)，菌株死亡率適中，正突變率也最高，達(dá)到25.7%。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)中確定CuSO4劑量為0.04%。

以ZH－1020為出發(fā)菌株，經(jīng)紫外誘變復(fù)合0.04%CuSO4抗性處理后，挑選187株抗性菌株進(jìn)行搖瓶初篩，對(duì)轉(zhuǎn)化率提高一定水平的正突變株進(jìn)行復(fù)篩，得到菌株132＃，經(jīng)3批實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，其轉(zhuǎn)化率較出發(fā)菌株提高了22.6%（表3 ）。

2.2 均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

對(duì)132＃菌株進(jìn)行轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化，均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4。

應(yīng)用均勻設(shè)計(jì)V4.0版軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，得到 的 回 歸 方 程 為：Y1＝ 54.72 － 0.64 X1X2＋0.0026 X1X3＋3.24－0.013 X2X3＋0.0008 X3X4－0.0099，R2＝0.9906。

表3 132＃菌株搖瓶篩選結(jié)果／%Tab.3 Flask fermentation results of strain 132＃／%

表4 均勻設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.4 Results of uniform design experiment

回歸方程的方差分析及綜合最優(yōu)解見表5 和表6。

表5 回歸方程的方差分析Tab.5 The variance analysis of the regression equation

由表5 可知，回歸方程的F 值＞F0.05（6，3）、P 值＜0.05，說明方程擬合良好，具有極其顯著的意義。

表6 綜合最優(yōu)解Tab.6 The comprehensive optimum solution

由表6可知，優(yōu)化的轉(zhuǎn)化條件為：溫度30℃、培養(yǎng)基pH 值6.0、底物濃度2 400μg·mL－1、轉(zhuǎn)化時(shí)間56h。

2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

采用上述確定的優(yōu)化轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行3批驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，測(cè)定誘變菌株132＃的轉(zhuǎn)化率，每批實(shí)驗(yàn)取3個(gè)樣品的平均值，結(jié)果見表7。

表7 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果／%Tab.7 Results of verifying experiment／%

由表7可知，誘變菌株132＃在轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化后，轉(zhuǎn)化率又提高了28.3%，較出發(fā)菌株在原始轉(zhuǎn)化條件下提高了57.3%。

3 結(jié)論

（1）利用紫外誘變復(fù)合Cu2＋抗性處理棘白霉素B脫?；府a(chǎn)生菌，篩選得到了高產(chǎn)突變菌株132＃，其轉(zhuǎn)化率比出發(fā)菌株提高了22.6%。表明該菌株對(duì)紫外誘變復(fù)合Cu2＋抗性處理的誘變方法比較敏感，該方法是一種非常有效的篩選手段。

（2）利用均勻設(shè)計(jì)方法優(yōu)化的轉(zhuǎn)化條件為：溫度30℃、培養(yǎng)基pH值6.0、棘白霉素B濃度2 400μg·mL－1、轉(zhuǎn)化時(shí)間56h，誘變菌株132＃在優(yōu)化條件下的轉(zhuǎn)化率又提高了28.3%，相對(duì)于出發(fā)菌株在原始轉(zhuǎn)化條件下提高了57.3%，說明在合適的溫度下增加底物濃度并延長(zhǎng)轉(zhuǎn)化時(shí)間是提高轉(zhuǎn)化率的有效途徑。后續(xù)研究還可以通過發(fā)酵培養(yǎng)基配方優(yōu)化或嘗試其它誘變方法等進(jìn)一步提高菌種轉(zhuǎn)化率。

[1]DEBON O M，GORDEE R S.Antibiotics that inhibit fungal cell wall development[J］.Annu Rev Microbiol，1994，48（12）：471－497.

[2]MURDOCH D，PLOSKER G L.Anidulafungin[J］.Drug，2004，64（19）：2249－2258.

[3]陳頔，曹國穎，傅得興，等.棘白菌素類抗真菌藥的研究進(jìn)展[J］.中國新藥雜志，2007，16（14）：1082－1087.

[4]袁野.抗真菌藥物的研究進(jìn)展[J］.中南藥學(xué)，2013，11（3）：207－210.

[5]趙靜，錢繼岳，邢振堂，等.新型抗深部真菌感染藥物——棘白霉素類[J］.抗感染藥學(xué)，2011，8（1）：8－10.

[6]曹國穎，傅得興.新型棘白菌素類抗真菌藥阿尼芬凈[J］.中國新藥雜志，2005，14（11）：1358－1361.