譚 瀟 肖建華

1 邵陽醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，湖南省邵陽市 422000； 2 南華大學(xué)病原生物學(xué)研究所

近幾年，由于人民生活水平提高以及生活節(jié)奏快等因素的影響，全世界糖尿病患者逐年增加［1］，據(jù)WHO估計(jì)2025年，全世界糖尿病患者將會(huì)達(dá)到3億［2～4］之 多。 Ⅰ 型 糖 尿 病 （Type 1diabetes mellitus，T1DM）又名胰島素依賴型糖尿病或青少年糖尿病，是一種由T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的以免疫性胰島炎和選擇性胰島β細(xì)胞損傷為特征的自身免疫性疾?。ˋutoimmune disease，AID）。自身免疫性疾病的治療現(xiàn)在在醫(yī)學(xué)上還是個(gè)難題，沒有好的根治辦法，只能利用類固醇（steroids）來減緩因免疫系統(tǒng)攻擊組織所造成的炎癥反應(yīng)（inflammation）外，就是使用免疫抑制藥物（immuno－suppressant drugs），抑制免疫系統(tǒng)的作用。不過，這兩種方法都會(huì)造成嚴(yán)重的副作用，而且都只能減緩病情的發(fā)展速度，非根治疾病。國內(nèi)外一些研究機(jī)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，曼氏血吸蟲的有關(guān)抗原對(duì)自身免疫病有一定的拮抗作用［5～7］。2003年Zaccone P研究顯示，曼氏血吸蟲的SEA可限制NOD小鼠Ⅰ型糖尿病，來自SEA處理小鼠的脾細(xì)胞有減弱糖尿病發(fā)展成NOD嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷病的能力［8］。我國血吸蟲感染主要是日本血吸蟲引起的，因此通過對(duì)日本血吸蟲有關(guān)抗原對(duì)Ⅰ型糖尿病的血糖是否具有抑制作用的研究，來為自身免疫性疾病的治療提供新的研究思路。

1 主要實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料 SPF級(jí)，健康BALB／c雄性小鼠24只（18～22g／只）及家兔（2～3kg）2只購自南華大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部；日本血吸蟲感染性釘螺購自岳陽湖南省血吸蟲病防治研究所；鏈脲佐菌素（Streptozotocin，STZ）購自美國Sigma公司；血糖檢測儀購自北京怡成生物電子技術(shù)有限公司；檸檬酸、檸檬酸三鈉購自上海生物工程公司。

1.2 方法

1.2.1 日本血吸蟲可溶性成蟲抗原和蟲卵抗原的制備：（1）日本血吸蟲可溶性成蟲抗原（SWA）制備：取健康家兔（2～3kg／只），用1 000～1 500條日本血吸蟲尾蚴經(jīng)腹部皮膚貼片感染家兔，感染后45d左右，處死家兔，用門靜脈灌注法收集好日本血吸蟲成蟲，然后放入大EP管中，加一定量的無菌生理鹽水，勻漿器勻漿15min后再用超聲粉碎儀粉碎15min，然后放入－20℃冰箱內(nèi)1h，再置室溫溶解，又放入－20℃冰箱內(nèi)1h，這樣反復(fù)凍融3次后4℃14 000r／min離心30min，其上清液即為SWA，分裝后置－80℃凍存?zhèn)溆?。?）日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原（SEA）制備：將制備了日本血吸蟲SWA的家兔解剖，取肝臟洗凈，去除膽囊、血管和筋膜組織等，然后將其剪碎，洗凈表面殘留血液，再過濾，將其置入研缽中搗碎，8 000r／min離心3min。再將肝臟勻漿過濾，用80目、120目尼龍篩網(wǎng)依次過濾，留下濾液，又用300目尼龍篩網(wǎng)過濾后放入盆中，加100ml 1.2%NaCl溶液，室溫下靜置至溶液明顯分層，倒掉上清液，取沉淀物8 000r／min離心1min。去掉沉淀物上層白色的肝臟組織，如此反復(fù)離心3次，直至沉淀物底部為黃色。然后加入5ml 0.25%胃蛋白酶溶液，涂片，顯微鏡下觀察蟲卵，如蟲卵周圍的肝臟組織完全消化干凈則可終止消化，又用1.2%NaCl溶液洗滌，直到沉淀物中無纖維蛋白，（整個(gè)操作過程要控制水溫在8℃以下，以防蟲卵孵化）。收集純凈的血吸蟲蟲卵，用超聲粉碎儀粉碎15min，放入－20℃冰箱內(nèi)1h后室溫溶解，再放入－20℃冰箱內(nèi)1h，反復(fù)凍融3次，4℃14 000r／min離心30min，其上清液即為SEA，分裝后置－80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 實(shí)驗(yàn)性Ⅰ型糖尿病模型的構(gòu)建：雄性BALB／c小鼠（18～22g）24只，常規(guī)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，采用多次小劑量STZ給藥法（multiple lowdoses STZ，MLDSTZ）建立Ⅰ型糖尿病小鼠模型。配制0.1mol／L檸檬酸溶液和0.1mol／L檸檬酸三鈉溶液，然后用此兩液合成0.1mol／L，pH 4.4的檸檬酸緩沖液，然后將STZ（60mg／kg）溶于檸檬酸緩沖液中，實(shí)驗(yàn)小鼠禁食8h（不禁水）后經(jīng)腹腔注射STZ溶液，溶液配制好后盡快在30min內(nèi)完成注射，連續(xù)注射5d。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)小鼠分組：將24只造模成功的Ⅰ型糖尿病小鼠隨機(jī)分為A、B、C 3組（每組8只），A組為SWA免疫組；B組為SEA免疫組；C組為糖尿病模型對(duì)照組。

1.2.4 免疫實(shí)驗(yàn)性Ⅰ型糖尿病小鼠：配制0.01M磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.2），A組小鼠于腹部皮下多點(diǎn)免疫注射已制備好的日本血吸蟲SWA，B組小鼠于腹部皮下多點(diǎn)免疫注射已制備好的SEA，C組小鼠用PBS代替抗原進(jìn)行腹部皮下多點(diǎn)免疫注射，注射劑量為50μg／只，1周免疫1次，共免疫4周。

1.2.5 實(shí)驗(yàn)小鼠血糖檢測：末次免疫后采取實(shí)驗(yàn)小鼠尾靜脈血檢測血糖，1次／周，持續(xù)觀察4周。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：使用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)資料進(jìn)行多個(gè)獨(dú)立樣本LSD－t檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，P＜0.05表示有顯著差異。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

末次免疫后采取實(shí)驗(yàn)小鼠尾靜脈血檢測血糖，1次／周，持續(xù)觀察4周。檢測結(jié)果表明：B組實(shí)驗(yàn)小鼠的血糖免疫后第3周開始有所下降，到第4周左右為（9.85±1.17）mmol／L，比 A組實(shí)驗(yàn)小鼠血糖（12.11±0.67）mmol／L 和 C 組 實(shí)驗(yàn) 小 鼠 血 糖（12.14±1.25）mmol／L明顯下降，具有顯著性差異（P＜0.01）。而A組實(shí)驗(yàn)小鼠血糖與C組實(shí)驗(yàn)小鼠血糖相比，變化不大，無顯著性差異（P＞0.05）見圖1。

圖1 各組實(shí)驗(yàn)小鼠的血糖變化（mmol／L）

3 討論

Ⅰ型糖尿病是一種自身免疫病，體液免疫和細(xì)胞免疫都參與其病理過程，特別是細(xì)胞免疫作用尤為明顯，其特征表現(xiàn)為CD4＋T細(xì)胞調(diào)節(jié)功能失衡，CD4＋T是個(gè)不均一的亞群，可分為 Th1和 Th2［9］。Th1細(xì)胞能合成IL－2、IFN－γ、LT、IL－3、TNF－α和GM－CSF等細(xì)胞因子，導(dǎo)致炎性損傷和致病性免疫作用；而 Th2 能合成 TNF－α、IL－3、GM－CSF、IL－4、IL－5、IL－6等細(xì)胞因子，Th2通過分泌這些細(xì)胞因子來抑制Th1的作用［10］。機(jī)體正常情況下，Th1和Th2反應(yīng)可以相互調(diào)節(jié)，維持免疫系統(tǒng)的動(dòng)態(tài)平衡。如果這種平衡被打破，當(dāng)Th1細(xì)胞的炎性作用超過Th2細(xì)胞的保護(hù)作用，便會(huì)導(dǎo)致一系列病理反應(yīng)，如引起胰島β細(xì)胞被破壞，出現(xiàn)Ⅰ型糖尿病的典型表現(xiàn)即出現(xiàn)高血糖［11］。

本次研究主要用日本血吸蟲兩種常見抗原SWA、SEA免疫糖尿病模型小鼠，觀察對(duì)小鼠的血糖的影響作用。根據(jù)國內(nèi)外的一些研究顯示，日本血吸蟲感染早期和晚期的主要抗原分別是SWA和SEA［12］。日本血吸蟲尾蚴感染至發(fā)育為成蟲的過程中，人體主要產(chǎn)生Th1為主的免疫反應(yīng)，當(dāng)雌雄成蟲交配產(chǎn)卵后，體內(nèi)主要產(chǎn)生Th2為主的免疫反應(yīng)。SWA可能主要誘Th1為主的炎性反應(yīng)，而SEA可能具有使免疫反應(yīng)向Th2為主的保護(hù)性反應(yīng)偏移的功能，且不依賴于蟲卵是活的還是死的，這也是血吸蟲SEA成為應(yīng)用于自身免疫性疾病的前提條件。當(dāng)機(jī)體免疫反應(yīng)是Th2的保護(hù)作用為主，則Th1的炎性損傷和致病性免疫作用被抑制，胰島β細(xì)胞被破壞的作用也降低了，因此實(shí)驗(yàn)性Ⅰ型小鼠的血糖降低了。

［1］中華醫(yī)學(xué)會(huì)糖尿病學(xué)分會(huì).中國2型糖尿病防治指南（2010版）〔M〕.北京：北京大學(xué)醫(yī)學(xué)出版社，2011：4－5.

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