黃磊 石冰 鄭謙 蒙田 王?

1.廣州市第一人民醫(yī)院口腔科，廣州 510016；2.口腔疾病研究國家重點實驗室 華西口腔醫(yī)院（四川大學(xué)）；3.唇腭裂外科，成都 610041

近年來轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)已廣泛應(yīng)用在發(fā)育生物學(xué)研究中。應(yīng)用轉(zhuǎn)基因動物模型研究唇腭裂遺傳因素，為精確建立人類遺傳性疾病的動物模型提供了可能。甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子-2（thyroid transcription factor-2，TTF-2）屬于叉頭/螺旋翼結(jié)構(gòu)域蛋白家族，其基因在小鼠定位于4C2[1]，在人類定位于9q22[2]。TTF-2-/-小鼠和人TTF-2基因突變均表現(xiàn)為腭裂及甲狀腺發(fā)育不全等畸形[3-5]，這從一個側(cè)面證實TTF-2與腭裂的發(fā)生有一定關(guān)系。為觀察TTF-2基因高表達對腭突發(fā)育產(chǎn)生的影響，本研究構(gòu)建pBROAD3-TTF-2重組表達載體，通過顯微注射法將TTF-2重組表達載體注射入小鼠受精卵雄原核，建立TTF-2轉(zhuǎn)基因小鼠，在一定范圍內(nèi)增加TTF-2的表達，觀察TTF-2基因的活動規(guī)律和其表達產(chǎn)物（蛋白質(zhì)）的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF級成年C57BL/6J小鼠和昆明白小鼠，均購自四川大學(xué)實驗動物中心。

1.1.2 主要儀器 CO2孵箱（Sanyo公司，日本），顯微操作系統(tǒng)（Nikon公司，日本），立體解剖顯微鏡（Olympus公司，日本）；拉針儀、微鍛儀、毛細玻璃管（Narishage公司，日本），電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Red公司，美國），梯度聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀（Eppendorf公司，美國）。

1.1.3 主要試劑 PCR試劑盒，PCR產(chǎn)物回收試劑盒，DNA Marker，Kpn Ⅰ、Hind Ⅲ酶，以上試劑均購自寶生物工程（大連）有限公司；孕馬血清促性腺激素（pregnant mare serum，PMS）購自內(nèi)蒙古赤峰松山獸藥廠，人絨毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotrophin，hCG）購自寧波激素制品廠；膠回收試劑盒為日本QIAGEN公司產(chǎn)品，基因組提取試劑盒購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；α-32P-dCTP購自北京亞輝生物工程公司，羊抗小鼠TTF-2多克隆抗體IgG購自美國 Santa Cruz公司。

1.1.4 載體與菌株 pMD18-T與大腸桿菌JM109（Code No.D9052）購自寶生物工程（大連）有限公司；pBROAD3-mcs載體購自美國 InvivoGene公司。

1.2 方法

1.2.1 TTF-2轉(zhuǎn)基因表達載體的構(gòu)建 應(yīng)用DNA提取試劑盒，從C57BL/6J小鼠肝臟組織中提取基因組DNA，應(yīng)用PCR擴增TTF-2基因。擴增引物P1：5’-TATAGATCTATGACAGCCGAGAGCGCGCCGCCG-3’，含Kpn Ⅰ酶切位點；P2：5’-CTATCTAGATTACATGGCAGACACGAACCGATCC-3’，含Hind Ⅲ酶切位點。得到克隆載體pMD18-T-TTF-2，經(jīng)測序比對正確無突變堿基后，酶切回收TTF-2片段，再定向插入pBROAD3-mcs載體，構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pBROAD3-TTF-2并鑒定。

1.2.2 轉(zhuǎn)基因小鼠的制備 用PMS和hCG對4～6周齡質(zhì)量為12.5～14.0 g的雌性C57BL/6J小鼠進行超排卵后，與健康雄鼠合籠，從有精栓的小鼠輸卵管壺腹部將受精卵取出，向受精卵雄原核中注入DNA溶液，在CO2孵箱（37 ℃）中培養(yǎng)過夜，將發(fā)育成2-細胞的胚胎挑選出來，移植到昆明白假孕小鼠的輸卵管中[6]，培養(yǎng)12～15 d，觀察胎鼠腭突發(fā)育情況。

1.2.3 轉(zhuǎn)基因鼠基因組DNA的PCR鑒定 按常規(guī)方法提取基因組DNA[6]作為PCR模板，擴增ROSA26啟動子下游和TTF-2基因。引物P1’：5’-ACTCCCAGTTCAATTACAGCTGTTG-3’，P2’：5’-GGGCGGCGGTTGGTGTTACGTTTGG-3’；反應(yīng)參數(shù)：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性1 min，58 ℃退火1 min，72 ℃延伸30 s，35個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。循環(huán)延伸后，采用1%瓊脂糖凝膠電脈進行分析。

1.2.4 轉(zhuǎn)基因鼠基因組DNA Southern blot鑒定 用KpnⅠ和EcoRⅠ酶切pBROAD3-TTF-2質(zhì)粒，用回收的0.7 kb片段為模板，采用隨機引物法標(biāo)記探針。取待檢的TTF-2轉(zhuǎn)基因小鼠的DNA，用VspⅠ和XbalⅠ酶切，在2%瓊脂糖凝膠上電泳，待凝膠變性、中和后轉(zhuǎn)移至Hybond尼龍膜，然后固定、雜交，并曝光檢測。

1.2.5 轉(zhuǎn)基因小鼠腭突組織TTF-2蛋白表達的免疫組織化學(xué)檢測 取TTF-2轉(zhuǎn)基因小鼠（胚胎12～15 d）腭突，用4%甲醛緩沖液（pH=7.0）固定24 h后，石蠟包埋，5 μm厚連續(xù)切片，行免疫組織化學(xué)染色，DAB顯色。光鏡下觀察腭突中TTF-2的表達狀況。

2 結(jié)果

2.1 TTF-2轉(zhuǎn)基因表達載體的構(gòu)建

2.1.1 TTF-2基因的擴增結(jié)果 經(jīng)PCR擴增獲得TTF-2基因片段，其大小與理論值1 113 bp相符（圖1a）。

2.1.2 擴增片段的克隆與鑒定 克隆載體pMD18-TTTF-2經(jīng)轉(zhuǎn)化、擴增后，進行瓊脂糖凝膠電泳，其鑒定結(jié)果見圖1b。

2.1.3 重組表達質(zhì)粒的酶切鑒定 將重組表達質(zhì)粒pBROAD3-TTF-2擴增后行KpnⅠ和HindⅢ酶切鑒 定，其電泳結(jié)果見圖1c。

圖1 TTF-2轉(zhuǎn)基因表達載體的構(gòu)建Fig 1 Construction of plasmid pBROAD3-TTF-2

2.2 轉(zhuǎn)基因小鼠的制備

注射原核期受精卵982枚，發(fā)育為2-細胞胚胎580枚（圖2），均移植入48個假孕受體昆明白小鼠，得到胎鼠68只。有2只新生鼠出現(xiàn)腭裂（圖3），生后24 h死亡。小鼠胚胎腭突發(fā)育的組織學(xué)切片見圖4，觀察胚胎12～15 d（E12～E15）的腭突形態(tài)，轉(zhuǎn)基因組只是在胚胎15 d（E15）時腭突沒有融合而形成腭裂，其余時間對照組與轉(zhuǎn)基因組無明顯差別。

圖2 受精卵的顯微注射 倒置相差顯微鏡Fig 2 Microinjection of the fertilized ovum inverted phase contrast microscope

圖3 胚胎15 d時的腭突Fig 3 The palatal shelves on E15

2.3 轉(zhuǎn)基因鼠基因組DNA的PCR鑒定結(jié)果

68只胎鼠（包括2只腭裂新生鼠）經(jīng)PCR檢測，共有41只鼠可見到784 bp（TTF-2基因的一部分）的陽性條帶（圖5），2只腭裂新生鼠均有陽性條帶，陽性整合率為60.3%。

2.4 轉(zhuǎn)基因鼠DNA的Southern blot鑒定結(jié)果

以41份TTF-2 PCR陽性鼠的基因組DNA作為樣品，進行Southern blot檢測（圖6），結(jié)果表明，陽性轉(zhuǎn)基因小鼠共有13只，2只腭裂新生鼠均為轉(zhuǎn)基因陽性。

2.5 TTF-2蛋白在轉(zhuǎn)基因鼠腭突中的表達

轉(zhuǎn)基因組胚胎12～15 d的腭突中嵴上皮和間充質(zhì)中均可見TTF-2陽性細胞，且陽性表達無明顯差異（圖7）。

圖4 胚胎12～15 d腭突的發(fā)育過程 蘇木精-伊紅染色 × 100Fig 4 Development of the palatal shelves from E12 to E15 hematoxylin-eosin staining × 100

圖5 轉(zhuǎn)基因鼠DNA的PCR檢測Fig 5 Results of PCR using genomic DNA of the transgenic foetus

圖6 轉(zhuǎn)基因鼠DNA的Southern blot結(jié)果Fig 6 Results of Southern blots of the genome DNA

圖7 TTF-2在轉(zhuǎn)基因小鼠腭突發(fā)育過程中（胚胎12～15 d）的表達 DAB × 100Fig 7 TTF-2 expression in the palatal shelves on E12-15 in the transgenic mice DAB × 100

3 討論

建立TTF-2轉(zhuǎn)基因小鼠模型有利于在活體水平對TTF-2基因及功能進行實驗研究。因TTF-2基因僅含有1個外顯子而無內(nèi)含子，本研究采取以基因組DNA為模板用PCR方法將TTF-2基因593位點起始密碼子ATG至1 705位點終止密碼子TGA之間的基因片段進行擴增，將獲得的1 113 bp目的基因片段插入到ROSA26基因啟動子與人延長因子1-alpha（elongation factor 1-alpha，EF-1α）基因的3’-非翻譯區(qū)（3’-untranslated region，3’-UTR）區(qū)和poly（A）信號序列之間，構(gòu)建pBROAD3-TTF-2表達載體。該方法省略了從mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA的過程，更便捷、快速，同時降低了成本。

為使目的基因在轉(zhuǎn)基因小鼠中高表達，本研究選用了具有強啟動活性的ROSA26基因啟動子，它含有豐富的CpG區(qū)，可以在胚胎發(fā)育期和成年組織所有細胞中表達報告基因，同時因為pBROAD3載體有人EF-1α基因的3’-UTR區(qū)和poly（A）信號序列存在，可在體內(nèi)長時間有效表達報告基因產(chǎn)物[7-9]，這使得本研究構(gòu)建的pBROAD3-TTF-2表達載體完全符合轉(zhuǎn)基因動物制備的要求。

本研究采用目前最有效的受精卵原核顯微注射法，用PacⅠ酶切去掉載體原核片段同時線性化，將5.4 kb線性化pBROAD3-TTF-2表達載體注射入靠近細胞表面的雄原核，共注射982枚受精卵，注射后培養(yǎng)24 h，存活并發(fā)育為2-細胞胚胎的受精卵580枚，成功率為59%。將注射后2-細胞胚胎移植到同期發(fā)情的48只假孕受體獲得68只胎鼠，其中13只為TTF-2轉(zhuǎn)基因陽性，陽性整合率達19%，與其他學(xué)者的報道相似[10]。

本課題組在前期研究[11]中發(fā)現(xiàn)，TTF-2在腭突的表達呈時空特異性：在C57BL/6J小鼠胚胎12～15 d的腭突發(fā)育期，胚胎12 d時TTF-2出現(xiàn)表達，13 d時達到高峰，15 d時表達消失，腭突正常融合。TTF-2-/-小鼠和人類TTF-2基因純合突變均表現(xiàn)為腭裂及甲狀腺發(fā)育不全等畸形[3-5]，故推測TTF-2的表達與腭突發(fā)育密切相關(guān)。

本研究建立的TTF-2轉(zhuǎn)基因小鼠表現(xiàn)型為腭裂，免疫組織化學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)，從胚胎12～15 d，TTF-2在轉(zhuǎn)基因小鼠腭突中持續(xù)高表達，但是腭突的形態(tài)只是在胚胎15 d時沒有融合，其余時間與對照組無明顯差別。筆者推測，TTF-2轉(zhuǎn)基因小鼠在腭突發(fā)育時期TTF-2持續(xù)高表達而且失去時空特異性，可能是TTF-2轉(zhuǎn)基因小鼠發(fā)生腭裂的原因之一；但其確切原因還需進一步研究。

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