申愛娟， 陳 松 周曉嬰 戚存扣

(1.南京農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，江蘇 南京 210095;2.國家油料作物改良中心南京油菜分中心，江蘇 南京 210014;3.農(nóng)業(yè)部長江下游棉花與油菜重點實驗室，江蘇 南京 210014)

隨著轉(zhuǎn)基因作物在世界范圍內(nèi)商品化種植面積的日益擴大，對轉(zhuǎn)基因植物或產(chǎn)品檢測的需求日益增加，轉(zhuǎn)基因檢測技術(shù)發(fā)展迅速。目前已經(jīng)開發(fā)出多種基于蛋白質(zhì)和核酸的轉(zhuǎn)基因檢測技術(shù)［1-14］，其中PCR檢測技術(shù)因具有效率高、特異性強、可實現(xiàn)高通量且成本低廉的特點而得到廣泛應(yīng)用。根據(jù)檢測目標的差異，PCR檢測技術(shù)可細分為篩選檢測、基因特異性檢測、載體特異性檢測和事件特異性檢測方法。篩選檢測主要是針對一般性常用基因元件如CaMV 35S啟動子、NOS終止子和選擇標記基因的檢測，通常用于一般性轉(zhuǎn)基因成份的篩查;而基因特異性檢測是對特殊基因的檢測如抗除草劑基因等的檢測［7］;這2種檢測方法均難以區(qū)分含有相同的基因元件、選擇標記基因或功能基因的不同的轉(zhuǎn)基因植物或產(chǎn)品。此外CaMV 35S啟動子、NOS終止子作為存在于植物病原菌中的天然的DNA片段，有可能造成檢測的假陽性［9］;而載體特異性檢測是針對載體構(gòu)建特點設(shè)計的檢測技術(shù)［10］，其專一性相對較高，但是仍不能區(qū)分同一載體轉(zhuǎn)化獲得的不同轉(zhuǎn)基因植物。而事件特異性檢測是基于轉(zhuǎn)基因TDNA位點旁側(cè)序列特征建立起的PCR檢測技術(shù)。由于轉(zhuǎn)化過程中含有外源基因的T-DNA序列隨機插入到受體基因組中，因此每一個獨立、穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化事件都是特異性的。根據(jù)旁側(cè)序列設(shè)計引物，擴增包括部分T-DNA序列和部分基因組序列的融合序列，即所謂的轉(zhuǎn)化事件特異性檢測。轉(zhuǎn)化事件特異性檢測方法已經(jīng)被應(yīng)用于多種轉(zhuǎn)基因作物的檢測中［11-15］。

油菜屬十字花科蕓薹屬植物，是世界上種植面積較大的4種油料作物之一。菜籽油用途廣泛，可以用作食用油、生物柴油，也是油漆、軟化劑、表面活性劑等的加工原料;菜籽餅中蛋白質(zhì)含量高達40%，是優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)飼料來源。由于油菜的經(jīng)濟利用價值高，且與模式植物擬南芥同屬，易于轉(zhuǎn)化，因此是轉(zhuǎn)基因研究與應(yīng)用最活躍作物之一。國內(nèi)外轉(zhuǎn)基因油菜的研究涉及到多種性狀，包括抗除草劑、抗蟲、抗病、耐逆、雄性不育及品質(zhì)改良等，其中抗除草劑是商品化應(yīng)用最廣泛的性狀，抗除草劑油菜在美國、加拿大、澳大利亞均有大規(guī)模種植。

轉(zhuǎn)基因油菜W-4品系系江蘇省農(nóng)業(yè)科學院經(jīng)濟作物研究所油菜研究室通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將油菜fad2基因的ihpRNAi載體轉(zhuǎn)入甘藍型油菜Westar品種獲得的高油酸品系［16］。W-4品系種子中油酸含量達到80%以上，亞油酸、亞麻酸含量降低至3%～4%，且高油酸性狀能穩(wěn)定遺傳，具有潛在應(yīng)用價值。本研究通過TAIL-PCR法分離轉(zhuǎn)基因高油酸油菜W-4品系的T-DNA插入位點左右兩側(cè)的旁側(cè)序列，并根據(jù)旁側(cè)序列設(shè)計特異性PCR擴增引物，據(jù)此建立W-4轉(zhuǎn)化事件的特異性檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料 轉(zhuǎn)基因甘藍型油菜高油酸株系W-4系江蘇省農(nóng)業(yè)科學院經(jīng)濟作物研究所油菜研究室培育，其他轉(zhuǎn)基因甘藍型油菜株系T2、T3、A8、B6、R49、R54以及非轉(zhuǎn)基因?qū)φ崭仕{型油菜Westar均為江蘇省農(nóng)業(yè)科學院經(jīng)濟作物研究所油菜研究室中保存。所有轉(zhuǎn)基因株系均含有卡那霉素抗性基因。

1.1.2 擴增引物 左邊界旁側(cè)序列驗證引物，LBR1:5'-TGGCTACCCGTGATATTGCTGAAGA-3';LBR2:5'-GCCTTCTTGACGAGTTCTTCTGAGC-3';LBR3:5'-CCATAATAATGTGTGAGTAGTTCCC-3';LBF:5'-GTCGAGTGATATGAACTATGTGCAGG-3'。右邊界旁側(cè)序列驗證引物，RBF1:5'-ACTAATTGGATGACAAAGCAAATGG-3';RBF2:5'-GGACGCAGTCAGAAAGTCCAGAATG-3';RBF3:5'-GAAAACCCTGGCGTCCAACTTA-3';RBR:5'-TCCCAAATAGTTTGAATTGTTGAAG-3'。左邊界事件特異性擴增引物，TLF:5'-TCTTGAGATCCTTACCAATAGAGC-3';TLR:5'-TCCATAATAATGTGGAGTAGTTCC-3'。右邊界事件特異性引物，TRF:5'-AAGGAATCAATCACCGATGAAGAAAGC-3';TRR:5'-GAACCAAAATCAAACCGGAACCAAA-3';actin基因擴增引物對actF:5'-CGAGGCTCCTCTTAACCCAAAGG-3'和actR:5'-CACCAGAATCCAGCACAATACCG-3';NPTII基因擴增引物對nptF:5'-GCTGCCTCGTCCTGGAGTTCATT-3'和nptR:5'-GCACAACAGACAATCGGCTGCTC-3'。以上引物均由上海Invitrogen公司合成。

1.1.3 酶與試劑Tag酶系TaKaRa公司產(chǎn)品;克隆載體pEASY-T1購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取與純化 應(yīng)用常規(guī)CTAB方法從葉片中提取基因組DNA。RNase酶處理去除RNA，紫外分光光度計法檢測DNA質(zhì)量和濃度，用無菌水分別稀釋成50 ng/μl和100 ng/μl后備用。

1.2.2 T-DNA 插入位點旁側(cè)序列克隆采用TAILPCR方法，具體步驟同文獻［17］。

1.2.3 旁側(cè)序列PCR驗證 依據(jù)旁側(cè)序列設(shè)計左側(cè)擴增引物對(LBF1/LBR、LBF2/LBR、LBF3/LBR)和右側(cè)引物對(RBF1/RBR、RBF2/RBR、RBF3/RBR、RBF4/RBR)。以 W-4和 Westar基因組 DNA為模板，PCR擴增特異性條帶。反應(yīng)體系:PCR反應(yīng)體系20μl，基因組DNA 1μl(50 ng)，緩沖液(含MgCl2)2 μl，dNTPs(2 mmol/L)1.6 μl，LR Tag聚合酶0.5μl，上下游引物10 μmol/L各1μl，補水至20μl。擴增程序:95℃ 變性2 min，95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 45 s，35個循環(huán)后，再72℃下延伸5 min。1%瓊脂糖電泳分析擴增產(chǎn)物。

1.2.4 事件特異性檢測法 以轉(zhuǎn)基因油菜W-4、T2、T3、A8、B6、R49、R54 和非轉(zhuǎn)基因油菜 Westar的基因組DNA以及無菌水(空白對照)做模板，分別用引物對 TLF/TLR、TRF/TRR、actF/actR、NPTF/NPTR進行 PCR擴增。檢驗 LBF/LBR、RBF/RBR引物對擴增的特異性。反應(yīng)體系同方法1.2.3。退火溫度依此為58℃、58℃、55℃、56℃。

1.2.5 檢測靈敏度試驗 用濃度為100 ng/μl非轉(zhuǎn)基因油菜DNA和同樣濃度的轉(zhuǎn)基因油菜W-4的基因組 DNA，按照質(zhì)量百分比配置分別含有100.00%、50.00%、10.00%、5.00%、1.00%、0.50%、0.10%、0.05%、0的轉(zhuǎn)基因油菜W-4的基因組DNA。用事件特異性引物對進行PCR擴增，反應(yīng)體系同方法1.2.4。1%瓊脂糖電泳分析擴增產(chǎn)物。

2 結(jié)果

2.1 旁側(cè)序列克隆與分析

圖1 左邊界旁側(cè)序列Fig.1 Flanking sequence to left border

左邊界經(jīng)3輪TAIL-PCR擴增，獲得大小約750 bp的產(chǎn)物，經(jīng)克隆、測序，并剔除克隆載體序列后，最終獲得大小為641 bp的序列。與轉(zhuǎn)化載體pCNFIRnos T-DNA左邊界序列比對，結(jié)果顯示，366～641 bp序列與載體左邊界序列高度同源，推測1～365 bp序列為T-DNA的左邊界的旁側(cè)序列(圖1)，此段油菜基因組序列的堿基組成為G+C含量32.60%、A+T含量為67.40%。右邊界經(jīng)4輪擴增，獲得500 bp的產(chǎn)物，經(jīng)克隆、測序并剔除克隆載體序列后，獲得大小為470 bp的序列(圖2)，與轉(zhuǎn)化載體 pCNFIRnos T-DNA右邊界序列比對，其中1～180 bp與載體序列完全一致，因此推測 181～470 bp序列為T-DNA右邊界的旁側(cè)序列，是油菜基因組序列，其堿基組成為G+C含量31.27%、A+T含量為68.73%。W-4的T-DNA左、右邊界序列的旁側(cè)序列堿系組成相似，A+T含量均為67.00%左右，表明T-DNA整合在油菜基因組中A/T堿基豐富區(qū)。CGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCGCATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCC CAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGCTAGAGCAGCTTGAGCTTGGATCAGATTGTCGTTTCCCGCCTTCAGCCGAGGAGAGCTTTGCTTTGATATT TTGGATATCAGTTTACTTCGGATTGGATGGATGACATCTATATAGGAACTGGCGAATTTTCAGTTCGGATGGGCTCGAATGGTTTTA GATTCGGTAAAACTTGGAATCAGAAATACTTGTAAAATTTGGTTCCGGTTTGATTTTGGTTCGATTATTTTAGGTAATTCAATAAAGT ATAAAATATTTCAGGTAAAATATAGAACGAATAAAATCTTCAACAATTCAAACTATTTGGGATATTTCAGATAGAAATATTATGATAT TT黑體部分為基因組序列;斜體部分為T-DNA序列。

2.2 旁側(cè)序列的驗證

根據(jù)獲得的左、右邊界旁側(cè)序列分別設(shè)計2條引物(LBF和 RBR)，分別與 LBF1、LBF2、LBF3和RBF1、RBF2、RBF3、RBF4 組成引物對。以轉(zhuǎn)基因油菜基因組DNA為模板，進行PCR擴增。結(jié)果左側(cè)擴增產(chǎn)物為800 bp、700 bp和600 bp;右側(cè)擴增產(chǎn)物為 750 bp、650 bp、600 bp、450 bp，與預期產(chǎn)物大小完全一致(圖3)。證明所獲得的油菜基因組序列與載體左右邊界序列相連，是T-DNA插入位點的旁側(cè)序列。

圖3 旁側(cè)序列的PCR驗證Fig.3 Flanking sequence verification by PCR

2.3 W-4轉(zhuǎn)化事件特異性及靈敏度檢測

2.3.1 PCR特異性檢測 以轉(zhuǎn)基因油菜W-4、T2、T3、A8、B6、R49、R54 和非轉(zhuǎn)基因油菜 Westar的基因組DNA以及無菌水(空白對照)做模板，用引物對 TLF/TLR、TRF/TRR、actF/actR、nptF/nptR 分別進行PCR擴增。擴增體系正常的情況下actF/actR引物在所有樣品中均擴增出152 bp的產(chǎn)物(圖4a)。鑒于本試驗的轉(zhuǎn)基因油菜均有卡那霉素抗性基因，nptF/nptR引物在除Westar和空白對照外均擴增出預期產(chǎn)物130 bp(圖4b);而引物TLF/TLR和TRF/TRR僅在W-4基因組DNA中有擴增產(chǎn)物，預期大小分別為485 bp和405 bp，而在其他轉(zhuǎn)基因油菜、非轉(zhuǎn)基因油菜和空白對照中沒有的擴增產(chǎn)物(圖4c與圖4d)。PCR擴增結(jié)果表明，引物對TLF/TLR、TRF/TRR能特異性識別W-4轉(zhuǎn)化事件。

2.3.2 PCR擴增靈敏度檢測 以非轉(zhuǎn)基因油菜DNA溶液梯度稀釋過的轉(zhuǎn)基因油菜W-4的基因組DNA為模板，分別用左、右兩側(cè)事件特異性引物(TLF/TLR、TRF/TRR)進行PCR擴增，左、右兩側(cè)引物均能擴增出特異性目標片段。擴增產(chǎn)物的亮度隨著稀釋度的增加或W-4基因組DNA量的減少而減弱(圖5)。靈敏度檢測結(jié)果顯示，引物對TLF/TLR、TRF/TRR在 W-4基因組DNA濃度稀釋到0.10%～0.05%時仍能擴增出特異性條帶，表明根據(jù)W-4左、右邊界旁側(cè)序列設(shè)計的事件特異性檢測引物特異性強、靈敏度高。

3 討論

T-DNA旁側(cè)序列分析一直是轉(zhuǎn)基因植物研究的熱點，對于闡述T-DNA整合方式、染色體定位、轉(zhuǎn)基因表達活性等具有重要意義。通過旁側(cè)序列分析發(fā)現(xiàn):T-DNA右邊界序列通常比左邊界序列更保守，T-DNA整合過程中左邊界序列發(fā)生缺失的頻率高于右邊界序列［18-19］;盡管普遍認為農(nóng)桿菌介導的轉(zhuǎn)基因相比其他轉(zhuǎn)化方法單拷貝或寡拷貝的整合頻率更高，但是在同一染色體位點也常發(fā)生多拷貝整合的現(xiàn)象［20］;在一些轉(zhuǎn)基因植物中T-DNA整合位點的選擇并非完全隨機，T-DNA整合區(qū)域多為A/T堿基豐富區(qū);對轉(zhuǎn)基因擬南芥的研究發(fā)現(xiàn)T-DNA整合位點與染色體上基因分布的密度相關(guān)，T-DNA插入位點傾向于基因間區(qū)域，整合在外顯子區(qū)域和內(nèi)含子區(qū)域的頻率沒有顯著性差異［21］;T-DNA插入位點位于重復區(qū)域的頻率較低［22］，這可能是選擇的結(jié)果。有報道稱T-DNA左右邊界附近的序列與插入位點的旁側(cè)序列有部分同源(Microsimilarity)的現(xiàn)象［23-24］，這可能是 T-DNA整合位點的一種選擇機制;T-DNA插入常伴隨受體基因組序列的缺失、重排、易位等變化。因此說T-DNA整合過程是個復雜的異常重組過程，還有許多未知問題尚待研究。

圖4 不同引物PCR的特異性檢測Fig.4 Specificity detection with different primers by PCR

圖5 轉(zhuǎn)基因W-4事件特異性PCR靈敏度檢測Fig.5 Sensitivity detection for event-specific PCR

本研究通過TAIL-PCR方法分離到轉(zhuǎn)基因油菜W-4基因組中與T-DNA左右邊界序列相連的旁側(cè)序列分別為 365 bp和 290 bp，左、右旁側(cè)序列的A+T含量分別為67.40%、68.73%。表明 W-4轉(zhuǎn)基因插入位點位于染色體中A/T豐富區(qū)。ATRich是非編碼區(qū)的典型特征，據(jù)此可以推測W-4轉(zhuǎn)基因插入位點可能處于非編碼區(qū)。進一步將這兩段序列分別與蕓薹屬白菜和甘藍基因組數(shù)據(jù)庫現(xiàn)有的序列比對，左邊界旁側(cè)序列與A08、C08部分序列同源，而右邊界則與A09、和C08部分序列同源。由于目前獲得的W-4的T-DNA插入位點的旁側(cè)序列片段較小，加上目前已有的蕓薹屬基因組數(shù)據(jù)庫信息尚不完整，因此根據(jù)目前的序列信息還難以對W-4的插入位點進行精確定位。

轉(zhuǎn)基因油菜品系W-4是轉(zhuǎn)基因途徑獲得的高油酸油菜品系，含一個拷貝的轉(zhuǎn)基因［17］。遺傳分析顯示W(wǎng)-4的高油酸性狀受1對顯性單基因控制遺傳，且轉(zhuǎn)基因表達穩(wěn)定［25］。W-4作為一個高油酸新種質(zhì)，在油菜高油酸育種上的應(yīng)用前景廣闊，但是W-4是轉(zhuǎn)基因材料，在其應(yīng)用與環(huán)境釋放前需要對其進行轉(zhuǎn)基因生物安全評價，并需要建立W-4的轉(zhuǎn)基因事件特異性檢測技術(shù)。

本研究根據(jù)W-4左右邊界旁側(cè)序列分別設(shè)計了2對特異性引物用于定性PCR檢測，以油菜actin基因為擴增體系對照，以其他6種含有卡那霉素選擇基因的轉(zhuǎn)基因油菜品系為轉(zhuǎn)基因陽性對照，以Westar為轉(zhuǎn)基因陰性對照。試驗結(jié)果顯示，actF/actR引物對在所有油菜的DNA樣品中均能擴增到特異性產(chǎn)物，說明擴增體系正常;nptF/nptR引物對除了陰性對照外所有轉(zhuǎn)基因樣品中均擴增到產(chǎn)物;引物對LBF/LBF、RBF/RBR僅在W-4中檢測到特異性產(chǎn)物，而在其他轉(zhuǎn)基因油菜中沒有擴增條帶，說明LBF/LBF、RBF/RBR引物對轉(zhuǎn)基因油菜W-4具有高度特異性。PCR靈敏度檢測結(jié)果顯示，應(yīng)用LBF/LBF、RBF/RBR引物檢測靈敏度可以達到0.10% ～0.05%，表明根據(jù)品系W-4左、右邊界融合序列設(shè)計的定性PCR檢測體系具有穩(wěn)定性好、特異性強和靈敏度高的特點，適用于轉(zhuǎn)基因油菜品系W-4的定性檢測。

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