沈興家，王力剛，韋博尤，朱 娟，唐順明，趙巧玲

(1.江蘇科技大學(xué)蠶業(yè)研究所，江蘇鎮(zhèn)江212018)

(2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所，江蘇鎮(zhèn)江212018)

(3.廣西蠶業(yè)科學(xué)研究院，廣西南寧530007)

家蠶是一種重要的經(jīng)濟昆蟲和模式生物，家蠶滯育機理研究一直受到學(xué)界的關(guān)注并取得了重要進展［1－3］.家蠶滯育是由滯育激素(DH)與家蠶滯育激素受體(BmDHR)結(jié)合，通過抑制環(huán)鳥苷酸(cGMP)的合成，上調(diào)下游海藻糖酶基因(Bmtre)的表達，從而促進海藻糖轉(zhuǎn)化成葡萄糖，滯育發(fā)生［4－6］.根據(jù)生物信息學(xué)分析，家蠶滯育激素受體基因有5種剪接方式，即轉(zhuǎn)錄成5種mRNA，其中Bmdhr－1與Bmdhr－2編碼的氨基酸序列相同，因此共編譯4種蛋白質(zhì) BmDHR－1，－3，－4，－5［7］.其中，BmDHR－1是一種 G 蛋白偶聯(lián)受體，能特異性結(jié)合滯育激素，偶聯(lián)Gq蛋白，通過鈣離子和蛋白激酶C參與激活下游滯育信號，使家蠶卵巢細胞內(nèi)的海藻糖酶活性增高［4］.

海藻糖酶(EC3.2.1.28)是昆蟲體內(nèi)重要的糖酶，也是昆蟲體內(nèi)唯一能夠水解海藻糖的酶類，它能專一性地將1分子海藻糖水解為2分子的葡萄糖［8］，產(chǎn)生的葡萄糖最終作為昆蟲細胞進行生命活動的原料［9－11］.在二化性家蠶中，受滯育信號的影響，蛹體表現(xiàn)出激活卵巢海藻糖酶的表達活性［12］，促進血液中的海藻糖轉(zhuǎn)化［6，13－14］.伴隨著滯育的啟動，糖原被轉(zhuǎn)化成多元醇，如具有冷凍保護作用的山梨醇和甘油［15］.但是，在分子水平上驗證BmDHR對下游海藻糖酶基因(Bmdhr)的調(diào)控作用則尚未見報道.文中以pcDNA3.1載體為骨架構(gòu)建真核表達載體，用家蠶核型多角體病毒的ie－1啟動子啟動Bmdhr基因的表達［16］，利用家蠶細胞瞬時表達系統(tǒng)，在滯育激素的刺激下體外分析海藻糖酶啟動子的活性，驗證BmDHR的功能.

1 實驗

1.1 材料與主要試劑

家蠶二化性品種“秋豐”，宿主菌E.coli Top10菌株、pcDNA3.0載體、pMD－ie－1質(zhì)粒(ie－1啟動子片段長度為 646 bp，兩端分別含 BglⅡ和BamHⅠ限制性酶切位點)［16］、p3Z －Bmtre－luc表達質(zhì)粒，p3Z －Bmtre質(zhì)粒［17］，以及包含 Bmdhr基因 cDNA 的各種質(zhì)粒(pMD18 － Bmdhr)［7］均由本實驗室構(gòu)建并保存.

各種限制性內(nèi)切酶、ExTaq酶、T4 DNA連接酶、質(zhì)粒載體pMD18－T和pGL3.0 basic載體等購自寶生物工程(大連)有限公司.TC－100昆蟲細胞培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、Lipofectin試劑購自Invitrogen公司;熒光素酶檢測試劑盒(E4030)購自Promega公司.滯育激素(MW:2731.01)由上海強耀生物科技有限公司合成［18］.

1.2 Bmdhr cDNA片段克隆

根據(jù)家蠶滯育激素受體基因Bmdhr mRNA－1，mRNA －3，mRNA －4，mRNA －5 序列，分別設(shè)計上游引物Bmdhr－F:GGTACCATGAACTCAGAAACAATAAACGA(含BamHⅠ位點);4個下游引物分別為:Bmdhr －1－R AAGCTTGATTGCCATCTGAGTAGC(含 HindⅢ位點，下同)，Bmdhr－3－R AAGCTTGACGGCGGTATCATTG，Bmdhr－4－R AAGCTTATTGATTGCCATCTGAGTAGC，Bmdhr－5－R AAGCTTCCTAAATGTATTGTTTGTAAGC.其合成、測序委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成.

分別以各種包含Bmdhr cDNA的質(zhì)粒pMD18－Bmdhr為模板用上述上、下游引物進行PCR擴增，程序為:95℃ 3 min;95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃45 s，共30個循環(huán);72℃ 7 min.以1%瓊脂糖凝膠電泳檢驗PCR產(chǎn)物，并委托生工生物工程(上海)股份有限公司測序.

1.3 表達載體構(gòu)建

將上述測序正確的各種PCR片段經(jīng)BamHⅠ－BglⅡ雙酶解后，分別連接到經(jīng)同樣雙酶解的pMD－ie－1質(zhì)粒中，在top 10菌株中篩選重組質(zhì)粒pMD－ie1－Bmdhr;再分別經(jīng)BamHⅠ－HindⅢ雙酶切后，回收酶切產(chǎn)物片段ie－1－Bmdhr，分別連接到經(jīng)同樣 BamHⅠ －HindⅢ雙酶切的 pcDNA3.0載體中，構(gòu)建BmDHR表達載體pcDNA－ie1－Bmdhr，并進行酶切鑒定.

1.4 細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

家蠶細胞BmN參照文獻［19］的方法進行細胞培養(yǎng)傳代.細胞用24孔板培養(yǎng)24h后用于轉(zhuǎn)染.在100 μL反應(yīng)體系中，分別用5 μL Lipofectin包埋1 μg表達質(zhì)粒與p3Z－Bmtre－luc報告質(zhì)粒制成轉(zhuǎn)染液.轉(zhuǎn)染前傾去舊培養(yǎng)基，用無血清培養(yǎng)基輕洗滌2次，加1 mL無血清TC－100培養(yǎng)基，加入100 μL轉(zhuǎn)染液混勻，溫育細胞4～5 h，除去舊培養(yǎng)基，加入1mL含100nmol/L滯育激素濃度和10%FBS的TC－100培養(yǎng)基.以p3Z－Bmtre－luc報告質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細胞為對照，每組試驗重復(fù)3次.

1.5 熒光素酶活性分析

細胞轉(zhuǎn)染72 h后，5 000 g 4℃離心5 min收集細胞，去上清液，按照E4030試劑盒(Promega)的說明裂解細胞.加100 μL熒光素酶底物于測定管中，然后加入20 μL的細胞裂解液混勻，在LuminoMeter 20/20熒光光度計上測定熒光素酶(LUC)活性(2 s延遲，10 s讀數(shù))，以相對熒光強度單位(relative luminescence unit，RLU)表示［18，20］.平行測定細胞總蛋白濃度，以校正報告質(zhì)粒的熒光素酶活性值［16］.使用SPSS軟件進行差異性分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 Bmdhr基因cDNA的擴增與表達質(zhì)粒的構(gòu)建

家蠶滯育激素受體基因cDNA的PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳分離，經(jīng)測序與報道的基因序列一致，可用于后續(xù)研究.

各重組質(zhì)粒pMD－Bmdhr經(jīng)M13引物雙向測序后，得到的Bmdhr cDNA序列與預(yù)期序列一致，Bmdhr－1，－3，－4，－5分別為1311，810，1104和804 bp，表明已得到正確的目的片段，可以進行表達質(zhì)粒的構(gòu)建.對構(gòu)建的表達質(zhì)粒pcDNA－ie1－Bmdhr－1，－3，－4，－5進行 BamHⅠ －HindⅢ雙酶切鑒定，結(jié)果正確(圖略)，可用于真核表達.

2.2 BmDHR對Bmtre基因啟動子活性的影響

將上述構(gòu)建的表達質(zhì)粒pcDNA－ie1－Bmdhr1，pcDNA －ie1－Bmdhr3，pcDNA －ie1－Bmdhr4，pcDNA－ie1－Bmdhr5分別與 p3Z－Bmtreluc報告質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染BmN細胞，以p3Z－Bmtreluc報告質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細胞為陽性對照，載體p3ZBmtre轉(zhuǎn)染的細胞為空白對照，4～5 h后用含100 nM滯育激素的培養(yǎng)基替換舊培養(yǎng)基.72 h后檢測LUC活性，并經(jīng)空白對照和總蛋白量矯正.結(jié)果如圖1所示，在100 nM的滯育激素影響下，表達Bm-DHR－1、－3、－4和－5載體共轉(zhuǎn)染分別使海藻糖酶基因啟動子的活性提高2.4，2.8，1.7，2.2倍，達到顯著水平(F=12.041，P=0.026＜0.05).

2.3 BmDHR－1與BmDHR－5共表達分析

將表達質(zhì)粒pcDNA－ie－1－Bmdhr－1，pcDNA－ie－1－Bmdhr－5 DNA 按不同摩爾比(0∶4，1∶1，3∶1，1∶3，4∶0)與 p3Z － Bmtre－luc報告質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染BmN細胞，以p3Z－Bmtre－luc報告質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細胞為陽性對照，載體p3Z－Bmtre轉(zhuǎn)染的細胞為空白對照，4～5 h后用含100 nM滯育激素的培養(yǎng)基替換舊培養(yǎng)基.72 h后檢測LUC活性，并經(jīng)空白對照和總蛋白量矯正，結(jié)果如圖2所示.在100 nM的滯育激素作用下，對照組海藻糖酶啟動子活性為11 504.33±500.67，圖2顯示不同摩爾比的 Bmdhr－1/BmDHR －5(1∶1，3∶1，1∶3)分別使海藻糖酶啟動子的活性提高3.1，3.5，2.3倍，達到顯著水平(F=8.465，P=0.029 ＜0.05).其中，摩爾比為1∶1和3∶1時，海藻糖酶啟動子的活性極顯著高于BmDHR－1或BmDHR－5單獨作用(F=58.951，P=0.001 55 ＜ 0.01;F=107.364，P=0.00049＜0.01;F=29.472，P=0.00558＜0.01;F=60.9872，P=0.00145 ＜0.01);比例為1∶3 時與二者單獨作用時相當(dāng)，差異不顯著(以與BmDHR－5單獨作用的差異分析為例，F(xiàn)=7.099，P=0.057＞0.05).

圖2 不同摩爾比的BmDHR－1/BmDHR－5對海藻糖酶啟動子活性的影響Fig.2 Effects of different Mole ratio of BmDHR －1/BmDHR－5 on Bmtre promoter activities

3 結(jié)論

文中分別構(gòu)建了家蠶4個滯育激素受體Bm-DHR－1，－3，－4，－5的表達質(zhì)粒，利用家蠶細胞瞬時表達系統(tǒng)，體外分析了家蠶不同滯育激素受體或其組合對海藻糖酶基因啟動子活性的影響.由于BmDHR必須與DH結(jié)合才能調(diào)控下游基因的表達［4－6］，因此在家蠶細胞共轉(zhuǎn)染表達質(zhì)粒和報告質(zhì)粒后的培養(yǎng)基中加入人工合成的家蠶DH(100 nM).

在滯育激素作用下，Bmdhr－1、－3、－4和 －5分別單獨表達時，均上調(diào)家蠶Bmtre啟動子的活性，證明BmDHR能上調(diào)下游基因Bmtre的表達.但是，4種BmDHR對Bmtre上調(diào)倍數(shù)存在差異，由高到低依次為BmDHR－3、BmDHR－1、BmDHR－5、BmDHR－4，生物信息學(xué)分析顯示4個BmDHR的一級氨基酸序列同源性很高，前5次跨膜結(jié)構(gòu)完全一致［7］，表明BmDHR調(diào)節(jié)海藻糖酶啟動子的活性部位可能在前5次跨膜區(qū)域.

G蛋白偶聯(lián)受體可以通過組成二聚體發(fā)揮作用，其中包括同源二聚體和異源二聚體兩種類型［21］.形成二聚體的G蛋白偶聯(lián)受體在功能上的變化也有不同，有的會增加活性，有的會減弱活性，甚至?xí)?dǎo)致受體脫敏或發(fā)生內(nèi)吞作用［22］.家蠶滯育激素受體屬于G蛋白偶聯(lián)受體，BmDHR－1和BmDHR－5在蛹期血液中相對表達量很高，而其他幾個受體的表達量較低［7］，即 BmDHR－1和BmDHR－5是導(dǎo)致蠶卵滯育的主要受體.因此，本實驗選擇BmDHR－1與BmDHR－5表達載體在BmN細胞中進行同表達.

不同摩爾比(1∶3，1∶1 和 3∶1)的 BmDHR －1/BmDHR－5表達載體，與p3Z－Bmtre－luc共轉(zhuǎn)染BmN細胞后，熒光素酶活性均呈上調(diào)現(xiàn)象，且熒光素酶活性隨著BmDHR－5摩爾比的減小，上調(diào)倍數(shù)逐漸升高.說明BmDHR－1/BmDHR－5共表達上調(diào)Bmtre基因的表達;BmDHR－5的過量表達對BmDHR－1的活性有一定的抑制作用.但是當(dāng)只有BmDHR－1單獨表達時，對luc基因上調(diào)倍數(shù)反而比BmDHR－1/BmDHR－5比例為3∶1時低，這是否由于BmDHR－1大量積累后形成同源二聚體，導(dǎo)致自身脫敏，從而失去受體作用，還需要進一步實驗研究.

References)

［1］Xu W.Research advancement of insect diapause［J］.Chinese Bulletin of Entomology，2008，45(2):512 －517.

［2］顧燕燕，華榮勝，時連根.家蠶胚胎滯育的分子機理研究［J］.科技通報，2008，24(6):842－846.Gu Yanyan，Hua Rongsheng，Shi Liangen.Molecular research progress on embryonic diapause of the silkworm，bombyx mori［J］.Bulletin of Science and Technology，2008，24(6):842 －846.(in Chinese)

［3］黃君霆.家蠶滯育分子機制的研究［J］.蠶業(yè)科學(xué)，2003，29(1):1－6.Huang Junting.Studies oil the molecular mechanism of diapause in the silkworm，bombyx mori［J］.Acta Sericologica Sinica，2003，29(1):1 －6.(in Chinese)

［4］Homma T，Watanabe K，Tsurumaru S，et al.G protein-coupled receptor for diapause hormone，an inducer of Bombyx embryonic diapause［J］.Biochemical and Biophysical Research Communications，2006，344(1):386－393.

［5］Kitagawa N，Shiomi K，Imai K，et al.Establishment of a sandwich ELISA system to detect diapause hormone，and developmental profile of hormone levels in egg and subesophageal ganglion of the silkworm，Bombyx mori［J］.Zoological Science，2005，22(2):213 －221.

［6］Yamashita O，Hasegawa K，Seki M.Effect of the diapause hormone on Trehalase activity in pupal ovaries of the silkworm，Bombyx mori L［J］.General and Comparative Endocrinology，1972，18:515 －523.

［7］王力剛，宋海韜，黃勇，等.催青溫度對家蠶二化性品種滯育激素受體基因表達的影響及基因的結(jié)構(gòu)特征［J］.蠶業(yè)科學(xué)，2011，37(2):215－223.Wang Ligang，Song Haitao，Huang Yong，et al.Influence of incubation temperature on expression of diapause hormone receptor genes in bivoltine bombyx mori variety and structural features of the gene［J］.Acta Sericologica Sinica，2011，37(2):215 － 223.(in Chinese)

［8］Wyatt G R.The biochemistry of sugars and polysaccharides in insects［J］.Advances in Insect Physiology，1967，4:287－360.

［9］Kunieda T，F(xiàn)ujiyuki T，Kucharski R，et al.Carbohydrate metabolism genes and pathways in insects:insights from the honey bee genome［J］.Insect Molecular Biology，2006，15(5):563 －576.

［10］Suarez R K，Darveau C，Welch K C，et al.Energy metabolism in orchid bee flight muscles:carbohydrate fuels all［J］.Journal of Experimental Biology，2005，208:3573－3579.

［11］Montooth K L，Marden J H，Clark A G.Mapping determinants of variation in energy metabolism，respiration and flight in Drosophila［J］.Genetics，2003，165(2):623－35.

［12］Holman G M，Nachman R，Wright M.Insect neuropeptides［J］.Annual Review of Entomology，1990，35:201－217.

［13］Kamei Y，Hasegawa Y，Niimi T，et al，Trehalase－2 protein contributes totrehalase activity enhanced by diapause hormone in developing ovaries of the silkworm，Bombyx mori［J］.Journal of Insect Physiology，2011，57(5):608－613.

［14］Yamashita O，Yaginuma T.Insects at Low Temperature:Silkworm eggs at low temperatures:implications for sericulture［M］.New York:Chapman and Hall，1991:424－445.

［15］Yaginuma T，Kobayashi M，Yamashita O.Distinct effects of different low temperatures on the induction of NAD－sorbitol dehydrogenase activity in diapause eggs of the silkworm，Bombyx mori［J］.Journal of Comparative Physiology B:Biochemical，Systemic，and Environmental Physiology，1990，160:277 －285.

［16］Zhou Yajing，Xiao Qingli，Zhang Zhifang，et al.Foreign insect hormones stimulating the transcription of the ie－1 promoter of Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus in vivo and in vitro［J］.Bioscience Biotechnology and Biochemistry，2002，66(7):1488－1494.

［17］沈興家，唐順明，易詠竹，等.家蠶、野桑蠶海藻糖酶基因啟動子的特性及其滯育激素的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)［J］.蠶業(yè)科學(xué)，2004，30(2):147 －150.Shen Xingjia，Tang Shunming，Yi Yongzhu.Characterization of trehalase gene promoters from silkworm，bombyx mori and bombyx mandarina and transcriptional regulatoryeffects of diapause hormone on them［J］.Acta Sericologica Sinica，2004，30(2):147 － 150.(in Chinese)

［18］王力剛，朱娟，王猛，等.昆蟲激素體外調(diào)節(jié)家蠶滯育激素受體基因的表達［J］.江蘇科技大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版，2013，27(4):391－395.Wang Ligang，Zhu Juan，Wang Meng，et al.Insect hormones regulate expression of diapause hormone receptor gene of the silkworm(Bombyx mori)in vitro［J］.Journal of Jiangsu University of Science and Technology:Natural Science Edition，2013，27(4):391 －395.(in Chinese)

［19］Summers M D，Smith G E.A manual of methods for baculovirus vectors and insect cell culture procedures［M］.USA:Bulletin B－Texas Agricultural Experiment Station，1987:10－18，38－46.

［20］Zhao Qiaoling，Shen Xingjia，Zhu Liangjun，et al.Characterization of cib1 gene promoter from silkworm，Bombyx mori［J］.Zeitschrift Fur Naturforschung Section C －A Journal of Biosciences，2007，62(11/12):875－880.

［21］Paul S H P，F(xiàn)ilipek S，Wells J W，et al.Oligomerization of G Protein-coupled receptors:past，present，and future［J］.Biochemistry，2004，43(50):15643 －15656.

［22］Hebert T E，Moffett S，Morello J P，et al.A peptide derived from a β2 － adrenergic receptor transmembrane domain inhibits both receptor dimerization and activation［J］.Journal of Biological Chemistry，1996，271(27):16384－16392.