廖兆貴

(恩施市舞陽農(nóng)業(yè)服務中心，湖北恩施445000)

零余子為薯蕷科植物薯蕷(Dioscoreaopposita Thunb.)葉腋間的珠芽［1－2］，俗稱“山藥豆”，呈卵圓形或橢圓形，直徑約0.4～2cm，外表皮淡黃色，有細皺紋，頂端中間略有莖痕，質(zhì)堅硬，斷面黃褐色角質(zhì)樣，亦有光澤.氣味淡而不苦，口嚼粘膩，零余子含有16種氨基酸、膽堿、尿素、植酸、多種維生素、淀粉酶、山藥素等物質(zhì)，自古就是營養(yǎng)價值很高的滋補食品和藥用價值很高的藥材，可食用，還具醫(yī)療價值.

植物黃酮含量測定中最為關鍵的一步是黃酮的提取，不同的溶劑對不同植物黃酮的提取能力又有明顯的不同，因而提取溶劑的選擇至關重要［3］.黃酮類物質(zhì)的分離純化的方法有很多，有大孔樹脂的柱層析、紙層析、高效液相色譜技術等，但紙層析是黃酮類物質(zhì)的傳統(tǒng)而適應面廣的一種純化技術.通過資料檢索發(fā)現(xiàn)，目前對零余子的研究報道較少，而對其黃酮的研究未見報道，同時現(xiàn)已證實，黃酮類化合物具有多種生理功能和藥用價值［4－5］，因此本文主要對零余子的黃酮的提取工藝及初步分離進行了探討.

1 材料與方法

1.1 試驗材料

零余子粉:經(jīng)干燥粉碎后過40目篩收集于棕色試劑瓶中，備用.

1.2 試驗試劑

蘆丁標準品(≥95%)、無水乙醇、甲醇、丙酮、亞硝酸鈉、硝酸鋁、正丁醇、冰醋酸、異丙醇、濃氨水以上試劑均為分析純(國藥集團化學試劑有限公司).

1.3 儀器設備

UV1900PC紫外光譜儀(上海亞研電子科技有限公司);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠);SHZ－CB型循環(huán)水式多用真空泵(河南鞏義市英裕予華儀器廠);電子恒溫水浴鍋(深圳國華儀器廠);FA2104電子天平(上海天平儀器廠);800B離心機(上海安亭儀學儀器廠);85－2恒溫磁力攪拌機(江蘇中大儀器廠);紫外燈;層析缸等.

1.4 試驗方法

1.4.1 薯蕷零余子黃酮化合物的溶劑優(yōu)化 稱取三份零余子粉，各0.5 g，分別按料液比為1∶20加入60%甲醇，60%乙醇，60%丙酮進行回流提取，提取時間為2 h，提取次數(shù)為1次，提取溫度為75℃.將提取液離心(4000 r/min，15 min)，收取上清液定容至50 mL，取2 mL測定吸光度值，確定最佳提取溶劑.

1.4.2 零余子黃酮的提取工藝優(yōu)化 以乙醇為溶劑，選擇提取溫度、溶劑的體積分數(shù)、回流時間、回流次數(shù)4個因素，料液比均為1∶20，采用L9(34)正交設計，從而對其提取條件進行優(yōu)化，因素和水平見表1.

提取時準確稱取0.5 g的零余子粉9份按正交設計表分別提取，將提取液過濾，離心，定容后測定吸光度值［6］.

1.4.3 黃酮的測定方法 標準曲線的制作:配制濃度為1.0 mg/mL 的蘆丁標準溶液，吸取0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 蘆丁標準溶液(相當于0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg 蘆丁)分別置于 10 mL容量瓶中，再加5%亞硝酸鈉溶液0.3mL，搖勻，加10%硝酸鋁溶液0.3 mL，搖勻，加入4%氫氧化鈉溶液4 mL，再加乙醇稀至刻度，搖勻，放置12 min后，用1 cm比色皿，在波長510 nm處測定吸光度 A［7］.以蘆丁含量(mg)為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線，用最小二乘法進行線性回歸，得到回歸方程 A=0.0065+1.0057C，r=0.9998.

薯蕷零余子黃酮的測定:將提取液離心(4000 r/min，15 min)，定容至50 mL的棕色容量瓶，移取2 mL提取液入10 mL容量瓶中，測定方法同標準曲線，根據(jù)回歸方程計算測試液中黃酮含量C(mg)，則樣品中黃酮含量計算式為:

表1 因素水平表Tab.1 The factors and levels

其中:T為為供試液總量(mL);V為測定時吸取的樣品量(mL);W為樣品重量(g).

1.4.4 回收率試驗［8］取3個10 mL容量瓶，在已知黃酮含量的提取液中分別加一定體積的1.0 mg/mL蘆丁標準對照品溶液，分別測其黃酮含量，根據(jù)所測得的黃酮量減去提取液中黃酮含量，再除以加標量即可計算回收率.

1.4.5 零余子黃酮的紙層析分離純化 試驗選取三種不同的展層劑，第一種為雙向紙層析［9－10］:

1)第一展開劑為正丁醇∶冰醋酸∶水=3∶1∶1，第二展開劑15%醋酸(HOAC)，取濃縮液10 μL，將其點析濾紙(16 cm×16 cm)右下角距層析紙兩邊距離各3.5 cm處，反復點樣，吹干，使其直徑控制在3 mm左右.將點好樣品的層析紙放入盛有第一展開劑的層析缸中，采用上行法，使樣品斑點與展開劑液面相距1 cm左右.蓋好層析缸，當展開劑的前沿上行至距紙邊約3 cm左右時，取出層析紙晾干.將風干的層析紙旋轉(zhuǎn)90℃，放入盛第二展開劑的層析缸中，方法同上.

2)第二種展層劑為甲醇∶水∶異丙醇=20∶1∶3［11］，取濃縮液10 μL，點樣于新華慢性層析紙上，直至在紫外燈下呈1 cm的綠色斑點為止.將層析紙放入層析缸內(nèi)展開.當溶劑前沿到達離層析紙前沿約3 cm時將層析紙從缸中取出，用鉛筆標出溶劑前沿，再將其吹干.

3)第三種展層劑為甲醇:冰醋酸:水=20∶15∶85，點樣和展層方法同第二種.

1.4.6 紫外燈檢查 將得到的干燥的層析紙先在紫外燈下觀察，紀錄觀察結(jié)果，而后用氨氣熏，將盛有濃氨水的100 mL廣口瓶的瓶口與每個斑點接觸約5s，再于紫外燈下觀察，紀錄其顏色變化［10］.

1.4.7 黃酮體比移值Rf的測定 將在紫外燈下有熒光的斑點用鉛筆一一標點，并用刻度尺量取原點到每一個熒光斑點圓心的距離和原點到溶劑前沿的距離.計算比移值Rf.

比移值=原點到黃酮體斑點中心的距離/原點到溶劑前沿的距離

2 結(jié)果分析

2.1 零余子黃酮化合物的提取溶劑優(yōu)化

由圖1可以看出，不同的提取溶液對黃酮的提取有一定的影響，實驗結(jié)果表明甲醇的提取黃酮能力最低，而丙酮的其次，乙醇的提取效果最好.

2.2 零余子黃酮的提取工藝優(yōu)化

試驗選取乙醇濃度(A)、回流時間(B)、回流次數(shù)(C)、回流溫度(D)四個因素進行L9(34)正交實驗，具體結(jié)果見表3，試驗結(jié)果進行極差分析和方差分析.

圖1 不同浸提溶劑對黃酮得率的影響Fig.1 The influence of bleaching solvent on the flavonoid yield

表2 L9(34)黃酮提取的正交試驗結(jié)果Tab.2 The results of orthogonal experiment

以K值作各因素不同水平的黃酮得率的直觀效果圖，見圖2.

采用SPSS 11.5軟件對表3實驗數(shù)據(jù)進行方差分析，結(jié)果見表3.

圖2 各因素水平的直觀效果圖Fig.2 The visual chart of all factors and levels

表3 正交實驗方差分析表Tab.3 The analysis of variance of the orthogonal experiment

由表3的極差分析可以得出黃酮化合物的最佳工藝是A3B2C3D2，結(jié)合表4的方差分析可以看出影響其得率的主次因素是A＞D＞B＞C，即乙醇的濃度最為顯著，其次是提取溫度，回流時間和回流次數(shù).隨著溶液濃度的提高和回流次數(shù)的增加，黃酮得率提高，隨著回流時間的增加得率先是較大幅度的提高而后有小幅下降，而提取溫度的增加先使得得率有所增加，但到75℃后影響不大.表5中各個因素水平的方差分析表也說明A、B、C三因素的各個水平間差異非常顯著，而D因素的2、3水平間差異不顯著.驗證試驗得出薯蕷零余子黃酮得率最高為5.494 mg/g.

表4 各個因素的各水平顯著性分析Tab.4 The significant analysis of different levels

2.3 回收率實驗

回收率是判斷分析結(jié)果的量化指標，也是重要的質(zhì)控手段，為了衡量零余子前處理過得和測試過程中黃酮類物質(zhì)的保留情況，本文進行了回收率的測定，具體見表6.由表6可見，回收率為98% ～102%，說明樣品處理及測試方法可行.

表6 零余子黃酮含量回收率試驗Tab.6 Recovery experiment results of flavonoid levels from Yams bubil

2.4 零余子黃酮的初步分離

經(jīng)過對不同的展層劑系統(tǒng)的層析紙熒光斑點的觀察，雙向紙層析和甲醇:水:異丙醇系統(tǒng)層析的熒光斑點呈現(xiàn)一條黃綠色光帶，而甲醇:冰醋酸:水系統(tǒng)層析的熒光斑點均勻分布并呈現(xiàn)不同的顏色，具體結(jié)果見圖3，故選用甲醇:冰醋酸:水為最佳展層劑.

以甲醇∶冰醋酸∶水(20∶15∶85)為紙層析的溶劑系統(tǒng)，經(jīng)紙層析并于紫外燈下檢查，以乙醇提取的黃酮被分離為4部分，第1部分顯紫紅色，2，3部分呈較淡的黃綠色，第4部分顯黃綠色，氨氣熏蒸后熒光顏色均不變，比移值分別是 Rf1=0.096，Rf2=0.280，Rf3=0.592，Rf4=0.771.

3 結(jié)論

1)零余子黃銅提取的最佳提取溶液為乙醇，乙醇提取零余子黃酮的最佳提取工藝是用80%的乙醇，回流時間為3h，回流次數(shù)為3次，提取溫度為75或85℃，最大得率為5.494mg/g.此時平均回收率為99.41%

2)采用紙層析對零余子黃酮進行分離純化，最佳展層劑為甲醇:冰醋酸:水=20:15:85，可將零余子黃酮分離為四種成分，但這四種成分的具體性質(zhì)還有待于研究.

圖3 零余子黃酮的紙層析Fig.3 The paperchromatograph map of flavonoids

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