楊雪蓮，張凱麗，李金玉，張秋晨，王成濤

（北京工商大學(xué)食品學(xué)院，北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心，北京100048）

3－甲硫基丙醇是多種發(fā)酵食品的主體風(fēng)味，廣泛應(yīng)用于香精香料調(diào)配和食品增香［1］.它有獨(dú)特的香味特征和低香氣閾值，是一類應(yīng)用非常廣泛的食用香料化合物，也是美國(guó)食用香料與提取物制造者協(xié)會(huì)公布的安全香料，且其市場(chǎng)需求日益增加［2－3］.然而，目前工業(yè)生產(chǎn)3－甲硫基丙醇的方法以化學(xué)法為主，雖然化學(xué)合成成本低廉，但存在諸多如原料毒性高、合成過程污染大、有毒副產(chǎn)物難于完全去除等問題［1，6］.

近年來，生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)香精香料已成為相關(guān)學(xué)者們研究的方向.利用微生物合成制備甲硫醇及其衍生香料不但安全、綠色、高效，而且在價(jià)格上具有明顯的優(yōu)勢(shì)，將會(huì)成為工業(yè)化生產(chǎn)甲硫醇類天然香料的理想途徑.目前，應(yīng)用酵母菌轉(zhuǎn)化3－甲硫基丙醇已有一些報(bào)道［2－6］.研究發(fā)現(xiàn)，蛋氨酸代謝的一條支路生成了甲硫醇.Philippe等［2］認(rèn)為，該支路存在一種具有去甲硫基或者裂解甲硫基活性的酶，即cys3（EC4.4.1.1）基因編碼的胱硫醚－γ－裂解酶（cystathionineγ－lyase），它可能參與了從蛋氨酸至甲硫醇的分解代謝.因此，敲除掉釀酒酵母中有甲硫基裂解酶活性的cys3基因有助于提高釀酒酵母生產(chǎn)3－甲硫基丙醇的產(chǎn)率.本研究以實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的敲除胱硫醚－γ－裂解酶基因cys3的基因工程菌株S288C－CYS3為基礎(chǔ)，通過單因素水平實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，獲得該工程菌代謝生產(chǎn)3－甲硫基丙醇的最優(yōu)發(fā)酵參數(shù)，為工程菌的開發(fā)利用提供技術(shù)支持.

1 材料與方法

1.1 菌株、培養(yǎng)基與試劑

重組菌菌株S288C－CYS3由實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保藏.

種子培養(yǎng)基—YPD培養(yǎng)基（g／L）：酵母粉10，蛋白胨20，葡萄糖20.

發(fā)酵培養(yǎng)基（g／L）：蛋氨酸4.0，磷酸二氫鉀8.0，磷酸氫二鉀6.0，氯化鎂0.01，氯化亞鐵0.02，硫酸鋅0.03，酵母提取物0.8，葡萄糖30，氯化鈉2.0.

酵母提取物，G418，B.R，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；甲醇，色譜純，F(xiàn)isher Scientific；3－甲硫基丙醇，色譜純，Sigma；其他試劑均為分析純.

1.2 儀器設(shè)備

1.3 方法

1.3.1 菌種的活化和培養(yǎng)

將保存于甘油管中的重組菌菌株S288C－CYS3經(jīng)活化傳代恢復(fù)活力后，轉(zhuǎn)接入種子培養(yǎng)基中，再以10%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，在溫度30℃，轉(zhuǎn)速200r／min，初始pH值5的條件下培養(yǎng)48h后取樣.

1.3.2 3－甲硫基丙醇含量檢測(cè)

培養(yǎng)結(jié)束后，收集發(fā)酵液于6 000r／min離心10min，取上清液留待產(chǎn)物檢測(cè).采用高效液相色譜法（高效液相色譜儀型號(hào)Agilent 1100，色譜柱SepaxHP－C18（4.6mm×250mm）測(cè)定3－甲硫基丙醇的含量.色譜條件：流動(dòng)相和甲醇－水的體積比為3∶7；流速1mL／min，30min；柱溫30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)215nm；進(jìn)樣量10μL［7］.

1.3.3 單因素實(shí)驗(yàn)

以3－甲硫基丙醇產(chǎn)量作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)發(fā)酵溫度（25，30，35，40，45℃）、接種量（6%，8%，10%，12%，14%）、初始pH（4，5，6，7，8）、搖床轉(zhuǎn)速（120，160，200，240，280r／min）、發(fā)酵時(shí)間（12，24，36，48，60h）5個(gè)因素進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)篩選，分別考察各因素水平對(duì)重組菌產(chǎn)3－甲硫基丙醇的影響.

1.3.4 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果選取因素水平，選取發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度、pH值3個(gè)因素為自變量，以3－甲硫基丙醇的產(chǎn)量為響應(yīng)值，進(jìn)行Box－Behnken中心組合設(shè)計(jì)［9］，如表1所示.利用軟件Design Expert 8.05對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，檢驗(yàn)擬合度和方差分析.最后討論預(yù)測(cè)模型的響應(yīng)面特征及其響應(yīng)值.

表1 實(shí)驗(yàn)因素及編碼水平Tab.1 Design table of factors and levels

1.3.5 模型驗(yàn)證

根據(jù)響應(yīng)面優(yōu)化所得出的最優(yōu)發(fā)酵條件進(jìn)行重組菌S288C－CYS3發(fā)酵培養(yǎng)，測(cè)定3－甲硫基丙醇的產(chǎn)量，并比較模型預(yù)測(cè)值，以分析驗(yàn)證模型的可靠性及實(shí)驗(yàn)方案的最優(yōu)性.

1.3.6 數(shù)據(jù)處理與分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)取3次平行實(shí)驗(yàn)的平均值.利用SAS 8.1及Microsoft Excel 2010軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)結(jié)果的顯著性分析和方差分析，并采用Design Expert 8.05軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析［10］.

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母工程菌產(chǎn)3－甲硫基丙醇的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

分別考察不同溫度、轉(zhuǎn)速、初始pH值、接種量、發(fā)酵時(shí)間對(duì)3－甲硫基丙醇產(chǎn)量的影響，結(jié)果如圖1所示.

圖1 單因素對(duì)3－甲硫基丙醇（3－MTP）產(chǎn)量的影響Fig.1 Effect single factor on 3－methylthio－propanol yield

由圖1a可知，3－甲硫基丙醇產(chǎn)量隨溫度的升高先升高后迅速降低，溫度為30℃時(shí)，產(chǎn)量最高，達(dá)到0.62g／L.溫度升高到45℃時(shí)，幾乎檢測(cè)不到3－甲硫基丙醇.圖1b中3－甲硫基丙醇產(chǎn)量隨初始pH值的增加先升高后降低.當(dāng)初始pH值大于5時(shí)，3－甲硫基丙醇的產(chǎn)量明顯下降.由圖1c可知，3－甲硫基丙醇的產(chǎn)量隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而提高，48～60h時(shí)達(dá)到最大值，但這段時(shí)間增長(zhǎng)速率緩慢，這可能是由于3－甲硫基丙醇是次級(jí)代謝產(chǎn)物，受到菌體自身調(diào)節(jié)機(jī)制的影響.方差分析顯示不同發(fā)酵溫度、初始pH值和發(fā)酵時(shí)間對(duì)該菌株產(chǎn)3－甲硫基丙醇的影響較為顯著（P＜0.01），所以選擇30℃、初始pH為5、發(fā)酵時(shí)間64h進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn).

圖1d表明了不同轉(zhuǎn)速對(duì)3－甲硫基丙醇產(chǎn)量的影響.轉(zhuǎn)速低于200r／min時(shí)，隨著搖床轉(zhuǎn)速增加，發(fā)酵液流體湍動(dòng)程度增大，氣相間的傳質(zhì)和液相中的傳質(zhì)過程加快，對(duì)菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化有利［8］，3－甲硫基丙醇產(chǎn)量逐漸提高.但攪拌過快，相應(yīng)的剪切力增加，對(duì)菌體有傷害，產(chǎn)量下降.圖1e可以看出，接種量為10%時(shí)3－甲硫基丙醇產(chǎn)量最高，接種量低于10%時(shí)，產(chǎn)物積累少；但接種量過大可能會(huì)引起菌體生長(zhǎng)過快，發(fā)酵液黏度增加而造成溶氧不足［11］，反而影響了3－甲硫基丙醇的積累.研究表明，微生物生長(zhǎng)到一定階段時(shí)，為適應(yīng)環(huán)境變化而產(chǎn)生了某些次級(jí)代謝產(chǎn)物，它們的合成受菌體細(xì)胞群體感應(yīng)調(diào)節(jié)［12］，3－甲硫基丙醇可能也屬于這類次級(jí)代謝產(chǎn)物.方差分析顯示不同轉(zhuǎn)速和接種量對(duì)該菌株產(chǎn)3－甲硫基丙醇的影響不顯著（P＞0.01）.因此，選擇搖床轉(zhuǎn)速200r／min，接種量為10%為最優(yōu)條件，在后期的響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中未進(jìn)一步考察.

2.2 酵母工程菌產(chǎn)3－甲硫基丙醇的響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果

2.2.1 回歸模型的建立

由圖1可知，對(duì)該基因工程菌轉(zhuǎn)化出3－甲硫基丙醇有顯著影響的因素有發(fā)酵溫度、初始pH、時(shí)間，其他因素對(duì)3－甲硫基丙醇產(chǎn)量影響不顯著.故選取此3個(gè)因素為自變量，3－甲硫基丙醇產(chǎn)量為響應(yīng)值，由Design Expert軟件設(shè)計(jì)出17組中心組合實(shí)驗(yàn)方案［13］，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果如表2所示.

表2 中心組合實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果Tab.2 Design and results of central composite test

采用Design Expert軟件對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到發(fā)酵時(shí)間（A）、發(fā)酵溫度（B）、初始pH值（C）之間的多項(xiàng)回歸方程為

2.2.2 回歸模型方差分析

對(duì)上述回歸方程進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3.

表3 回歸方程方差分析結(jié)果Tab.3 Analysis of variances for the developed regression equation

分析表3的結(jié)果可知，回歸模型的顯著性很高（P＜0.000 1），而失擬項(xiàng)非顯著（P＝0.050 7＞0.05），說明參與響應(yīng)面優(yōu)化的考察因素設(shè)計(jì)合理，未知因素對(duì)3－甲硫基丙醇產(chǎn)量干擾很小.因此，不需要引入更高次數(shù)的項(xiàng)，模型適當(dāng)［10，14］.此外，模型的回歸方程與實(shí)際情況擬合度好（R2為0.985 6），這表明模型較準(zhǔn)確地反映了3－甲硫基丙醇的產(chǎn)量與培養(yǎng)基發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度、pH值之間的關(guān)系，因此用該模型對(duì)釀酒酵母重組菌S288C－CYS3的培養(yǎng)條件進(jìn)行分析預(yù)測(cè)合理可行.F檢驗(yàn)可用于判定各變量對(duì)響應(yīng)值影響的顯著性，P值越小顯著性越高［14－15］.表中由回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)可知：模型中一次項(xiàng)A，B顯著（P＜0.01），C不顯著（P＞0.05）；二次項(xiàng)A2，B2，C2均處于顯著水平（P＜0.01）；交互項(xiàng)AB，AC，BC均不顯著（P＞0.05）.由于回歸方程一次項(xiàng)的回歸系數(shù)絕對(duì)值大小為A＞B＞C，所以，這3個(gè)因素對(duì)該菌代謝產(chǎn)3－甲硫基丙醇的影響大小依次為發(fā)酵時(shí)間＞發(fā)酵溫度＞初始pH.

2.2.3 響應(yīng)曲面圖及其等高線

釀酒酵母重組菌S288C－CYS3發(fā)酵溫度、時(shí)間、初始pH交互作用的響應(yīng)面曲線和等高線見圖2.

圖2直觀地反映了初始pH、時(shí)間和發(fā)酵溫度3因素與響應(yīng)值的對(duì)應(yīng)關(guān)系.在圖2中，不同因素交互效應(yīng)的強(qiáng)弱可以通過等高線的形狀進(jìn)行判定，橢圓形表示兩因素交互作用顯著，圓形則表示兩因素交互作用不顯著［16－19］.所以，由圖2可知，發(fā)酵時(shí)間對(duì)響應(yīng)值的影響最大，發(fā)酵溫度的影響也較大，二者均表現(xiàn)為陡峭曲線，初始pH對(duì)響應(yīng)值影響最小，表現(xiàn)為平滑曲線［20］.分析模型的回歸方程可知，二次項(xiàng)系數(shù)（A2，B2，C2）分別為－0.091，－0.042，－0.026，均為負(fù)值，這意味著立體分析圖中的拋物面開口向下，極大值是存在的.根據(jù)軟件計(jì)算結(jié)果可知［21］，工程菌產(chǎn)3－甲硫基丙醇的最佳發(fā)酵條件為發(fā)酵時(shí)間64.02h，發(fā)酵溫度30.99℃，初始pH值為5.09.在此條件下，3－甲硫基丙醇產(chǎn)量的預(yù)測(cè)值為0.698g／L.結(jié)合實(shí)際操作方便性和方差分析結(jié)果，確定最佳培養(yǎng)條件為發(fā)酵時(shí)間64h，發(fā)酵溫度為31℃，起始pH為5.

2.2.4 回歸模型的驗(yàn)證

在最優(yōu)發(fā)酵條件下，重復(fù)3次搖瓶實(shí)驗(yàn)以驗(yàn)證預(yù)測(cè)值.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，3－甲硫基丙醇產(chǎn)量的平均值（0.690g／L）與模型預(yù)測(cè)值（0.698g／L）高度吻合，擬合率達(dá)98.85%.因此可以推測(cè)出，回歸模型可靠準(zhǔn)確.最終結(jié)果顯示，優(yōu)化后的3－甲硫基丙醇產(chǎn)量較之前提高了14.96%.

圖2 發(fā)酵溫度、時(shí)間、pH對(duì)3－甲硫基丙醇（3－MTP）產(chǎn)量影響的響應(yīng)面立體分析圖及等高線Fig.2 Response surface and contour plots for the effects of temperature，time and pH value on 3－methylthio－propanol productivity

3 結(jié)論

通過單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)對(duì)釀酒酵母重組菌S288C－CYS3發(fā)酵產(chǎn)3－甲硫基丙醇的發(fā)酵條件進(jìn)行了研究，建立了二次多項(xiàng)式回歸模型以表征目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量與初始pH、時(shí)間和發(fā)酵溫度3因素的關(guān)系，并驗(yàn)證了模型的準(zhǔn)確性.最終得出釀酒酵母重組菌S288C－CYS3產(chǎn)3－甲硫基丙醇的最佳培養(yǎng)條件為發(fā)酵時(shí)間64h，發(fā)酵溫度31℃，起始pH值為5，接種量為10%，轉(zhuǎn)速為200r／min.在此條件下，3－甲硫基丙醇的產(chǎn)量高達(dá)0.690g／L，比發(fā)酵條件優(yōu)化前3－甲硫基丙醇的產(chǎn)量提高了14.96%.研究結(jié)果表明優(yōu)化方案的設(shè)計(jì)合理有效，能夠明顯提高釀酒酵母重組菌S288C－CYS3產(chǎn)3－甲硫基丙醇的產(chǎn)率.

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