胡秋實，蘇忠亮，何培青，李 江

（1.青島科技大學 化工學院，青島 山東 266042；2.國家海洋局 第一海洋研究所，青島 山東 266061）

卡拉膠是紅藻細胞壁中的一種親水性多糖，是由重復的α－（1，4）－D－吡喃半乳糖和β－（1，3）－D－吡喃半乳糖二糖單元為基本骨架，交替連接而成的線性硫酸多糖［1］。根據是否含有3，6內醚－D－半乳吡喃糖、硫酸基以及硫酸基在分子中的位置不同，可以將卡拉膠分為十幾種類型，工業(yè)上目前主要使用和生產的有κ－、λ－、ι－三種類型。目前，近80%的卡拉膠用于食品及與食品相關工業(yè)，其余近20%用于醫(yī)藥、輕工、紡織、化工和化妝品領域。有研究成果表明卡拉膠在醫(yī)藥領域有很大的應用價值而且具有多種生物活性，如抗病毒、抗氧化、抗凝血、免疫調節(jié)等［2－5］。但由于卡拉膠多糖分子質量太大，使得其溶解性差、很難被機體吸收，嚴重限制了卡拉膠在醫(yī)藥領域的應用。相比卡拉膠多糖，卡拉膠寡糖具有較小的相對分子質量，其溶解性、安全性和穩(wěn)定性也都有所增加。因為傳統(tǒng)的化學方法和物理降解方法反應條件不易控制、產物分布不均勻，所以利用反應條件溫和、底物專一的卡拉膠降解酶制備卡拉膠寡糖成為研究的熱點。因此開展對卡拉膠降解酶的研究具有深遠的理論意義和應用價值。

迄今為止，研究發(fā)現(xiàn)的卡拉膠酶多為熱不穩(wěn)定酶，當溫度高于60℃時就會迅速失活［6］。而來源于嗜熱微生物的高溫酶因其作用溫度高、熱穩(wěn)定性好等優(yōu)點，在多個生物工程領域具有巨大的應用潛能。熱泉是一個獨特的生態(tài)環(huán)境，其溫度一般在50℃以上，有些甚至高于100℃，因而生存于此環(huán)境的熱泉菌具有獨特的適應機制和新穎的代謝產物。近年來，有關高溫酶的研究日益廣泛，越來越多具有潛在應用前景的高溫酶被發(fā)現(xiàn)和應用，但有關高溫卡拉膠酶的研究還未見相關報道。

本研究從印尼熱泉中篩選出1株高產卡拉膠酶菌株，初步研究表明該酶的最適酶活高于70℃，具有良好的應用前景。本研究采用響應面法對其產酶的發(fā)酵條件和培養(yǎng)基進行了優(yōu)化，以提高其產酶量及穩(wěn)定性，從而為該高溫卡拉膠酶的分離純化、酶學性質研究、酶解特性及工業(yè)化應用提供基礎數據。

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 菌 種

產卡拉膠酶菌株分離自印尼熱泉水樣，保存于國家海洋局海洋生物活性物質重點實驗室超低溫冰箱（－80℃）。

1.1.2 培養(yǎng)基

液體培養(yǎng)基：蛋白胨3g，酵母粉3g，氯化鈉3g，蒸餾水1L；

固體培養(yǎng)基：蛋白胨3g，酵母粉3g，卡拉膠15g，瓊脂粉15g，氯化鈉3g，蒸餾水1L；

斜面培養(yǎng)基：蛋白胨5g，酵母粉1g，瓊脂粉15g，氯化鈉3g，蒸餾水1L。

1.2 方 法

1.2.1 酶活的測定－DNS法

取0.5mL的酶液加入到1mL的卡拉膠底物（含0.2%卡拉膠的0.2mol·L－1甘氨酸－NaOH緩沖液，pH 9.0）中，70℃反應15min，用100℃滅活10min的酶液作對照；取1mL反應物與1.5mL DNS試劑分別加入比色管中，沸水浴中加熱5min，立即冷卻至室溫，定容到25mL，搖勻，于520nm處測光吸收值；根據半乳糖標準曲線確定產生還原糖的量。1個酶活力單位（U）定義為：在該條件下，每分鐘產生1μg還原糖（以 D－半乳糖計）所需要的酶量［7］。

1.2.2 單因素篩選

將上述液體培養(yǎng)基作為發(fā)酵基本培養(yǎng)基，分別對接種量、C源、N源、金屬離子、pH值和培養(yǎng)溫度進行單因素變量實驗，其他發(fā)酵條件均與液體培養(yǎng)基相同，每組設置3個平行對照用DNS法測酶活。

1.3 響應面實驗

根據Plackett－Burman實驗（略）篩選出的4個顯著性因素，設計Box－Behnken試驗，根據設定參數進行一系列實驗，將實驗結果輸入 Design－Expert.V8.0.6軟件中。在 Design－Expert.V8.0.6軟件中進行二次響應面回歸分析并建立回歸模型、方差分析及可信度分析。

根據回歸方程及相應曲面確定最大值點以及其對應的因素的編碼水平，在該水平下進行發(fā)酵產酶實驗，比較實際值與預測值的差別，驗證模型的正確性［8］。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

本研究分別考察了培養(yǎng)溫度、pH值、C源、N源、金屬離子、接種量六種單因素變量對酶活的影響，結果表明各種環(huán)境因子對該菌的生物量（OD600）和酶活都有較顯著的影響。在綜合考慮環(huán)境因子對生物量和酶活影響的基礎上，初步確定培養(yǎng)溫度為50℃、pH 7.0及培養(yǎng)基成分（卡拉膠0.3%、蛋白胨0.3%、KCl 25 mmol·L－1、NaCl添加量3‰）（圖1）。

2.2 Box－Behnken實驗設計及結果

C源通過Plackett－Burman實驗篩選出了4個顯著性因素：培養(yǎng)溫度、卡拉膠質量分數、蛋白胨質量分數（N源）、KCl濃度，設計Box－Behnken實驗，考察了這4個顯著因素之間的交互作用及最佳取值。對這4個顯著因素的水平設計及編碼見表1，Box－Behnken實驗設計及結果見表2。

表1 Box－Behnken實驗因素及水平Table 1 Tested Factors and level values of Box－Behnken test

表2 N＝29的Box－Behnken實驗設計及結果Table 2 Experimental design and results of Box－Behnken test（N＝29）

根據Box－Behnken實驗結果（表2），以菌株Lc50－1發(fā)酵液酶活（U·mL－1）為響應值利用Design－Expert.V8.0.6軟件進行回歸分析，得到二次回歸模型：

Y＝8.7098－0.22867A－0.11517B＋0.18975C－0.044083D＋0.3015AB－1.656AC＋0.993AD－0.87775BC＋0.06725BD－0.264CD－2.21723A2－1.22298B2－0.64511C2－1.34711D2

由回歸方差分析（表3）可知：此模型回歸性顯著，回歸模型的R2＝93.87%，說明該模型可以解釋93.87%實驗所得菌株Lc 50－1酶活的變化，從而說明該模型與實際擬合較好，可用于菌株Lc 50－1酶活的分析與預測，適合菌株Lc 50－1發(fā)酵產酶條件的優(yōu)化。

表3 回歸方程的方程方差分析Table 3 Variance a Analysis of regression equation

2.3 響應面分析及最佳發(fā)酵條件的確定

利用Design－Expert軟件對回歸模型進行響應面分析得到6個響應面回歸分析圖（圖2～7），可直觀地反映出各因子的變化對響應值影響。

圖2 Y＝（A，B）的等高線圖及響應面立體分析圖Fig.2 Y＝（A，B）contour plot and response surface stereogram

圖3 Y＝（A，C）的等高線圖及響應面立體分析圖Fig.3 Y＝（A，C）contour plot and response surface stereogram

圖4 Y＝（A，D）的等高線圖及響應面立體分析圖Fig.4 Y＝（A，D）contour plot and response surface stereogram

圖5 Y＝（B，C）的等高線圖及響應面立體分析圖Fig.5 Y＝（B，C）contour plot and response surface stereogram

圖6 Y＝（B，D）的等高線圖及響應面立體分析圖Fig.6 Y＝（B，D）contour plot and response surface stereogram

圖7 Y＝（C，D）的等高線圖及響應面立體分析圖Fig.7 Y＝（C，D）contour plot and response surface stereogram

通過Design－Expert軟件進一步分析預測，達到最高酶活值時，其所對應的A、B、C、D四個因素的編碼值分別為－0.49、－0.48、1、－0.31，即培養(yǎng)溫度47.5℃（理論值47.45℃）、蛋白胨0.25%（理論值0.248%）、卡拉膠0.3%、KCl 21.55mmol·L－1（由于實驗室具體條件無法達到一些理論值的精確度，故選取與理論值最接近的值），此時預測最大酶活值為8.904U·mL－1。根據預測的最佳條件進行3組發(fā)酵實驗，得出的實際酶活值為：8.883 2U·mL－1、8.824 3U·mL－1、8.921 2U·mL－1，均與預測值8.904 1U·mL－1接近，說明該模型能夠較好地預測該菌實際發(fā)酵情況。

3 討 論

本研究從印尼熱泉水樣中篩選出的高產耐高溫卡拉膠酶菌株Lc 50－1，初步鑒定為芽孢桿菌屬（Bacillus.sp）。以往研究報道的產卡拉膠酶的菌種多是假單胞菌［12］、弧菌［13］、噬纖維菌［14］等，而對芽孢桿菌屬（Bacillus.sp）產卡拉膠酶的研究尚未見報道。該研究進一步豐富和擴大了現(xiàn)有的卡拉膠酶資源。

菌株Lc50－1所產的卡拉膠酶具有較高耐熱性和熱穩(wěn)定性，與已報道的卡拉膠酶［15－17］相比具有明顯優(yōu)勢，有望開發(fā)應用于高溫條件的工業(yè)生產中，避免多步反應和副反應過程，可為優(yōu)化工藝流程開辟一條新的途徑。

與傳統(tǒng)的正交實驗相比，響應面分析法具有周期短、精度高、實驗次數少等優(yōu)點，不僅能夠評價各因素對生物發(fā)酵過程的影響，并且還能探究幾個因素的交互作用，得到最佳條件，是優(yōu)化培養(yǎng)條件的有效方法。目前，響應面分析法已在生物技術的眾多領域，尤其是微生物產酶條件優(yōu)化方面得到廣泛應用［8－11］。本實驗經響應面法優(yōu)化后所得酶活與預測值較為吻合，從而說明該模型設計的合理有效性，優(yōu)化后發(fā)酵上清液的酶活比未優(yōu)化時提高了1.5倍。影響菌株卡拉膠酶產量和活力的因素，除菌種外，培養(yǎng)基組成和發(fā)酵條件也十分重要。因此，選擇適當的C源、N源及金屬離子并對其組成進行合理的設計和配制，使其既能滿足產酶微生物生長的需要，也能滿足菌株產酶的需要。本研究采用響應面法對產卡拉膠酶熱泉菌株Lc50－1的培養(yǎng)條件進行了優(yōu)化，有效提高了酶活和產量，從而為高溫卡拉膠酶及卡拉寡糖的開發(fā)利用提供了科學依據和技術支撐。

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