胡秋實，蘇忠亮，何培青，李 江

（1.青島科技大學 化工學院，青島 山東 266042；2.國家海洋局 第一海洋研究所，青島 山東 266061）

卡拉膠是紅藻細胞壁中的一種親水性多糖，是由重復的α－（1，4）－D－吡喃半乳糖和β－（1，3）－D－吡喃半乳糖二糖單元為基本骨架，交替連接而成的線性硫酸多糖［1］。根據(jù)是否含有3，6內醚－D－半乳吡喃糖、硫酸基以及硫酸基在分子中的位置不同，可以將卡拉膠分為十幾種類型，工業(yè)上目前主要使用和生產的有κ－、λ－、ι－三種類型。目前，近80%的卡拉膠用于食品及與食品相關工業(yè)，其余近20%用于醫(yī)藥、輕工、紡織、化工和化妝品領域。有研究成果表明卡拉膠在醫(yī)藥領域有很大的應用價值而且具有多種生物活性，如抗病毒、抗氧化、抗凝血、免疫調節(jié)等［2－5］。但由于卡拉膠多糖分子質量太大，使得其溶解性差、很難被機體吸收，嚴重限制了卡拉膠在醫(yī)藥領域的應用。相比卡拉膠多糖，卡拉膠寡糖具有較小的相對分子質量，其溶解性、安全性和穩(wěn)定性也都有所增加。因為傳統(tǒng)的化學方法和物理降解方法反應條件不易控制、產物分布不均勻，所以利用反應條件溫和、底物專一的卡拉膠降解酶制備卡拉膠寡糖成為研究的熱點。因此開展對卡拉膠降解酶的研究具有深遠的理論意義和應用價值。

迄今為止，研究發(fā)現(xiàn)的卡拉膠酶多為熱不穩(wěn)定酶，當溫度高于60℃時就會迅速失活［6］。而來源于嗜熱微生物的高溫酶因其作用溫度高、熱穩(wěn)定性好等優(yōu)點，在多個生物工程領域具有巨大的應用潛能。熱泉是一個獨特的生態(tài)環(huán)境，其溫度一般在50℃以上，有些甚至高于100℃，因而生存于此環(huán)境的熱泉菌具有獨特的適應機制和新穎的代謝產物。近年來，有關高溫酶的研究日益廣泛，越來越多具有潛在應用前景的高溫酶被發(fā)現(xiàn)和應用，但有關高溫卡拉膠酶的研究還未見相關報道。

本研究從印尼熱泉中篩選出1株高產卡拉膠酶菌株，初步研究表明該酶的最適酶活高于70℃，具有良好的應用前景。本研究采用響應面法對其產酶的發(fā)酵條件和培養(yǎng)基進行了優(yōu)化，以提高其產酶量及穩(wěn)定性，從而為該高溫卡拉膠酶的分離純化、酶學性質研究、酶解特性及工業(yè)化應用提供基礎數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 菌 種

產卡拉膠酶菌株分離自印尼熱泉水樣，保存于國家海洋局海洋生物活性物質重點實驗室超低溫冰箱（－80℃）。

1.1.2 培養(yǎng)基

液體培養(yǎng)基：蛋白胨3g，酵母粉3g，氯化鈉3g，蒸餾水1L；

固體培養(yǎng)基：蛋白胨3g，酵母粉3g，卡拉膠15g，瓊脂粉15g，氯化鈉3g，蒸餾水1L；

斜面培養(yǎng)基：蛋白胨5g，酵母粉1g，瓊脂粉15g，氯化鈉3g，蒸餾水1L。

1.2 方 法

1.2.1 酶活的測定－DNS法

取0.5mL的酶液加入到1mL的卡拉膠底物（含0.2%卡拉膠的0.2mol·L－1甘氨酸－NaOH緩沖液，pH 9.0）中，70℃反應15min，用100℃滅活10min的酶液作對照；取1mL反應物與1.5mL DNS試劑分別加入比色管中，沸水浴中加熱5min，立即冷卻至室溫，定容到25mL，搖勻，于520nm處測光吸收值；根據(jù)半乳糖標準曲線確定產生還原糖的量。1個酶活力單位（U）定義為：在該條件下，每分鐘產生1μg還原糖（以 D－半乳糖計）所需要的酶量［7］。

1.2.2 單因素篩選

將上述液體培養(yǎng)基作為發(fā)酵基本培養(yǎng)基，分別對接種量、C源、N源、金屬離子、pH值和培養(yǎng)溫度進行單因素變量實驗，其他發(fā)酵條件均與液體培養(yǎng)基相同，每組設置3個平行對照用DNS法測酶活。

1.3 響應面實驗

根據(jù)Plackett－Burman實驗（略）篩選出的4個顯著性因素，設計Box－Behnken試驗，根據(jù)設定參數(shù)進行一系列實驗，將實驗結果輸入 Design－Expert.V8.0.6軟件中。在 Design－Expert.V8.0.6軟件中進行二次響應面回歸分析并建立回歸模型、方差分析及可信度分析。

根據(jù)回歸方程及相應曲面確定最大值點以及其對應的因素的編碼水平，在該水平下進行發(fā)酵產酶實驗，比較實際值與預測值的差別，驗證模型的正確性［8］。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

本研究分別考察了培養(yǎng)溫度、pH值、C源、N源、金屬離子、接種量六種單因素變量對酶活的影響，結果表明各種環(huán)境因子對該菌的生物量（OD600）和酶活都有較顯著的影響。在綜合考慮環(huán)境因子對生物量和酶活影響的基礎上，初步確定培養(yǎng)溫度為50℃、pH 7.0及培養(yǎng)基成分（卡拉膠0.3%、蛋白胨0.3%、KCl 25 mmol·L－1、NaCl添加量3‰）（圖1）。

2.2 Box－Behnken實驗設計及結果

C源通過Plackett－Burman實驗篩選出了4個顯著性因素：培養(yǎng)溫度、卡拉膠質量分數(shù)、蛋白胨質量分數(shù)（N源）、KCl濃度，設計Box－Behnken實驗，考察了這4個顯著因素之間的交互作用及最佳取值。對這4個顯著因素的水平設計及編碼見表1，Box－Behnken實驗設計及結果見表2。

表1 Box－Behnken實驗因素及水平Table 1 Tested Factors and level values of Box－Behnken test

表2 N＝29的Box－Behnken實驗設計及結果Table 2 Experimental design and results of Box－Behnken test（N＝29）

根據(jù)Box－Behnken實驗結果（表2），以菌株Lc50－1發(fā)酵液酶活（U·mL－1）為響應值利用Design－Expert.V8.0.6軟件進行回歸分析，得到二次回歸模型：

Y＝8.7098－0.22867A－0.11517B＋0.18975C－0.044083D＋0.3015AB－1.656AC＋0.993AD－0.87775BC＋0.06725BD－0.264CD－2.21723A2－1.22298B2－0.64511C2－1.34711D2

由回歸方差分析（表3）可知：此模型回歸性顯著，回歸模型的R2＝93.87%，說明該模型可以解釋93.87%實驗所得菌株Lc 50－1酶活的變化，從而說明該模型與實際擬合較好，可用于菌株Lc 50－1酶活的分析與預測，適合菌株Lc 50－1發(fā)酵產酶條件的優(yōu)化。

表3 回歸方程的方程方差分析Table 3 Variance a Analysis of regression equation

2.3 響應面分析及最佳發(fā)酵條件的確定

利用Design－Expert軟件對回歸模型進行響應面分析得到6個響應面回歸分析圖（圖2～7），可直觀地反映出各因子的變化對響應值影響。

圖2 Y＝（A，B）的等高線圖及響應面立體分析圖Fig.2 Y＝（A，B）contour plot and response surface stereogram

圖3 Y＝（A，C）的等高線圖及響應面立體分析圖Fig.3 Y＝（A，C）contour plot and response surface stereogram

圖4 Y＝（A，D）的等高線圖及響應面立體分析圖Fig.4 Y＝（A，D）contour plot and response surface stereogram

圖5 Y＝（B，C）的等高線圖及響應面立體分析圖Fig.5 Y＝（B，C）contour plot and response surface stereogram

圖6 Y＝（B，D）的等高線圖及響應面立體分析圖Fig.6 Y＝（B，D）contour plot and response surface stereogram

圖7 Y＝（C，D）的等高線圖及響應面立體分析圖Fig.7 Y＝（C，D）contour plot and response surface stereogram

通過Design－Expert軟件進一步分析預測，達到最高酶活值時，其所對應的A、B、C、D四個因素的編碼值分別為－0.49、－0.48、1、－0.31，即培養(yǎng)溫度47.5℃（理論值47.45℃）、蛋白胨0.25%（理論值0.248%）、卡拉膠0.3%、KCl 21.55mmol·L－1（由于實驗室具體條件無法達到一些理論值的精確度，故選取與理論值最接近的值），此時預測最大酶活值為8.904U·mL－1。根據(jù)預測的最佳條件進行3組發(fā)酵實驗，得出的實際酶活值為：8.883 2U·mL－1、8.824 3U·mL－1、8.921 2U·mL－1，均與預測值8.904 1U·mL－1接近，說明該模型能夠較好地預測該菌實際發(fā)酵情況。

3 討 論

本研究從印尼熱泉水樣中篩選出的高產耐高溫卡拉膠酶菌株Lc 50－1，初步鑒定為芽孢桿菌屬（Bacillus.sp）。以往研究報道的產卡拉膠酶的菌種多是假單胞菌［12］、弧菌［13］、噬纖維菌［14］等，而對芽孢桿菌屬（Bacillus.sp）產卡拉膠酶的研究尚未見報道。該研究進一步豐富和擴大了現(xiàn)有的卡拉膠酶資源。

菌株Lc50－1所產的卡拉膠酶具有較高耐熱性和熱穩(wěn)定性，與已報道的卡拉膠酶［15－17］相比具有明顯優(yōu)勢，有望開發(fā)應用于高溫條件的工業(yè)生產中，避免多步反應和副反應過程，可為優(yōu)化工藝流程開辟一條新的途徑。

與傳統(tǒng)的正交實驗相比，響應面分析法具有周期短、精度高、實驗次數(shù)少等優(yōu)點，不僅能夠評價各因素對生物發(fā)酵過程的影響，并且還能探究幾個因素的交互作用，得到最佳條件，是優(yōu)化培養(yǎng)條件的有效方法。目前，響應面分析法已在生物技術的眾多領域，尤其是微生物產酶條件優(yōu)化方面得到廣泛應用［8－11］。本實驗經響應面法優(yōu)化后所得酶活與預測值較為吻合，從而說明該模型設計的合理有效性，優(yōu)化后發(fā)酵上清液的酶活比未優(yōu)化時提高了1.5倍。影響菌株卡拉膠酶產量和活力的因素，除菌種外，培養(yǎng)基組成和發(fā)酵條件也十分重要。因此，選擇適當?shù)腃源、N源及金屬離子并對其組成進行合理的設計和配制，使其既能滿足產酶微生物生長的需要，也能滿足菌株產酶的需要。本研究采用響應面法對產卡拉膠酶熱泉菌株Lc50－1的培養(yǎng)條件進行了優(yōu)化，有效提高了酶活和產量，從而為高溫卡拉膠酶及卡拉寡糖的開發(fā)利用提供了科學依據(jù)和技術支撐。

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