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        響應面法優(yōu)化熱泉菌Bacillus sp.Lc50-1的發(fā)酵產卡拉膠酶條件*

        2014-10-08 12:49:28胡秋實蘇忠亮何培青
        海洋科學進展 2014年2期
        關鍵詞:等高線圖卡拉膠面法

        胡秋實,蘇忠亮,何培青,李 江

        (1.青島科技大學 化工學院,青島 山東 266042;2.國家海洋局 第一海洋研究所,青島 山東 266061)

        卡拉膠是紅藻細胞壁中的一種親水性多糖,是由重復的α-(1,4)-D-吡喃半乳糖和β-(1,3)-D-吡喃半乳糖二糖單元為基本骨架,交替連接而成的線性硫酸多糖[1]。根據(jù)是否含有3,6內醚-D-半乳吡喃糖、硫酸基以及硫酸基在分子中的位置不同,可以將卡拉膠分為十幾種類型,工業(yè)上目前主要使用和生產的有κ-、λ-、ι-三種類型。目前,近80%的卡拉膠用于食品及與食品相關工業(yè),其余近20%用于醫(yī)藥、輕工、紡織、化工和化妝品領域。有研究成果表明卡拉膠在醫(yī)藥領域有很大的應用價值而且具有多種生物活性,如抗病毒、抗氧化、抗凝血、免疫調節(jié)等[2-5]。但由于卡拉膠多糖分子質量太大,使得其溶解性差、很難被機體吸收,嚴重限制了卡拉膠在醫(yī)藥領域的應用。相比卡拉膠多糖,卡拉膠寡糖具有較小的相對分子質量,其溶解性、安全性和穩(wěn)定性也都有所增加。因為傳統(tǒng)的化學方法和物理降解方法反應條件不易控制、產物分布不均勻,所以利用反應條件溫和、底物專一的卡拉膠降解酶制備卡拉膠寡糖成為研究的熱點。因此開展對卡拉膠降解酶的研究具有深遠的理論意義和應用價值。

        迄今為止,研究發(fā)現(xiàn)的卡拉膠酶多為熱不穩(wěn)定酶,當溫度高于60℃時就會迅速失活[6]。而來源于嗜熱微生物的高溫酶因其作用溫度高、熱穩(wěn)定性好等優(yōu)點,在多個生物工程領域具有巨大的應用潛能。熱泉是一個獨特的生態(tài)環(huán)境,其溫度一般在50℃以上,有些甚至高于100℃,因而生存于此環(huán)境的熱泉菌具有獨特的適應機制和新穎的代謝產物。近年來,有關高溫酶的研究日益廣泛,越來越多具有潛在應用前景的高溫酶被發(fā)現(xiàn)和應用,但有關高溫卡拉膠酶的研究還未見相關報道。

        本研究從印尼熱泉中篩選出1株高產卡拉膠酶菌株,初步研究表明該酶的最適酶活高于70℃,具有良好的應用前景。本研究采用響應面法對其產酶的發(fā)酵條件和培養(yǎng)基進行了優(yōu)化,以提高其產酶量及穩(wěn)定性,從而為該高溫卡拉膠酶的分離純化、酶學性質研究、酶解特性及工業(yè)化應用提供基礎數(shù)據(jù)。

        1 材料和方法

        1.1 材 料

        1.1.1 菌 種

        產卡拉膠酶菌株分離自印尼熱泉水樣,保存于國家海洋局海洋生物活性物質重點實驗室超低溫冰箱(-80℃)。

        1.1.2 培養(yǎng)基

        液體培養(yǎng)基:蛋白胨3g,酵母粉3g,氯化鈉3g,蒸餾水1L;

        固體培養(yǎng)基:蛋白胨3g,酵母粉3g,卡拉膠15g,瓊脂粉15g,氯化鈉3g,蒸餾水1L;

        斜面培養(yǎng)基:蛋白胨5g,酵母粉1g,瓊脂粉15g,氯化鈉3g,蒸餾水1L。

        1.2 方 法

        1.2.1 酶活的測定-DNS法

        取0.5mL的酶液加入到1mL的卡拉膠底物(含0.2%卡拉膠的0.2mol·L-1甘氨酸-NaOH緩沖液,pH 9.0)中,70℃反應15min,用100℃滅活10min的酶液作對照;取1mL反應物與1.5mL DNS試劑分別加入比色管中,沸水浴中加熱5min,立即冷卻至室溫,定容到25mL,搖勻,于520nm處測光吸收值;根據(jù)半乳糖標準曲線確定產生還原糖的量。1個酶活力單位(U)定義為:在該條件下,每分鐘產生1μg還原糖(以 D-半乳糖計)所需要的酶量[7]。

        1.2.2 單因素篩選

        將上述液體培養(yǎng)基作為發(fā)酵基本培養(yǎng)基,分別對接種量、C源、N源、金屬離子、pH值和培養(yǎng)溫度進行單因素變量實驗,其他發(fā)酵條件均與液體培養(yǎng)基相同,每組設置3個平行對照用DNS法測酶活。

        1.3 響應面實驗

        根據(jù)Plackett-Burman實驗(略)篩選出的4個顯著性因素,設計Box-Behnken試驗,根據(jù)設定參數(shù)進行一系列實驗,將實驗結果輸入 Design-Expert.V8.0.6軟件中。在 Design-Expert.V8.0.6軟件中進行二次響應面回歸分析并建立回歸模型、方差分析及可信度分析。

        根據(jù)回歸方程及相應曲面確定最大值點以及其對應的因素的編碼水平,在該水平下進行發(fā)酵產酶實驗,比較實際值與預測值的差別,驗證模型的正確性[8]。

        2 結果與分析

        2.1 單因素試驗結果

        本研究分別考察了培養(yǎng)溫度、pH值、C源、N源、金屬離子、接種量六種單因素變量對酶活的影響,結果表明各種環(huán)境因子對該菌的生物量(OD600)和酶活都有較顯著的影響。在綜合考慮環(huán)境因子對生物量和酶活影響的基礎上,初步確定培養(yǎng)溫度為50℃、pH 7.0及培養(yǎng)基成分(卡拉膠0.3%、蛋白胨0.3%、KCl 25 mmol·L-1、NaCl添加量3‰)(圖1)。

        2.2 Box-Behnken實驗設計及結果

        C源通過Plackett-Burman實驗篩選出了4個顯著性因素:培養(yǎng)溫度、卡拉膠質量分數(shù)、蛋白胨質量分數(shù)(N源)、KCl濃度,設計Box-Behnken實驗,考察了這4個顯著因素之間的交互作用及最佳取值。對這4個顯著因素的水平設計及編碼見表1,Box-Behnken實驗設計及結果見表2。

        表1 Box-Behnken實驗因素及水平Table 1 Tested Factors and level values of Box-Behnken test

        表2 N=29的Box-Behnken實驗設計及結果Table 2 Experimental design and results of Box-Behnken test(N=29)

        根據(jù)Box-Behnken實驗結果(表2),以菌株Lc50-1發(fā)酵液酶活(U·mL-1)為響應值利用Design-Expert.V8.0.6軟件進行回歸分析,得到二次回歸模型:

        Y=8.7098-0.22867A-0.11517B+0.18975C-0.044083D+0.3015AB-1.656AC+0.993AD-0.87775BC+0.06725BD-0.264CD-2.21723A2-1.22298B2-0.64511C2-1.34711D2

        由回歸方差分析(表3)可知:此模型回歸性顯著,回歸模型的R2=93.87%,說明該模型可以解釋93.87%實驗所得菌株Lc 50-1酶活的變化,從而說明該模型與實際擬合較好,可用于菌株Lc 50-1酶活的分析與預測,適合菌株Lc 50-1發(fā)酵產酶條件的優(yōu)化。

        表3 回歸方程的方程方差分析Table 3 Variance a Analysis of regression equation

        2.3 響應面分析及最佳發(fā)酵條件的確定

        利用Design-Expert軟件對回歸模型進行響應面分析得到6個響應面回歸分析圖(圖2~7),可直觀地反映出各因子的變化對響應值影響。

        圖2 Y=(A,B)的等高線圖及響應面立體分析圖Fig.2 Y=(A,B)contour plot and response surface stereogram

        圖3 Y=(A,C)的等高線圖及響應面立體分析圖Fig.3 Y=(A,C)contour plot and response surface stereogram

        圖4 Y=(A,D)的等高線圖及響應面立體分析圖Fig.4 Y=(A,D)contour plot and response surface stereogram

        圖5 Y=(B,C)的等高線圖及響應面立體分析圖Fig.5 Y=(B,C)contour plot and response surface stereogram

        圖6 Y=(B,D)的等高線圖及響應面立體分析圖Fig.6 Y=(B,D)contour plot and response surface stereogram

        圖7 Y=(C,D)的等高線圖及響應面立體分析圖Fig.7 Y=(C,D)contour plot and response surface stereogram

        通過Design-Expert軟件進一步分析預測,達到最高酶活值時,其所對應的A、B、C、D四個因素的編碼值分別為-0.49、-0.48、1、-0.31,即培養(yǎng)溫度47.5℃(理論值47.45℃)、蛋白胨0.25%(理論值0.248%)、卡拉膠0.3%、KCl 21.55mmol·L-1(由于實驗室具體條件無法達到一些理論值的精確度,故選取與理論值最接近的值),此時預測最大酶活值為8.904U·mL-1。根據(jù)預測的最佳條件進行3組發(fā)酵實驗,得出的實際酶活值為:8.883 2U·mL-1、8.824 3U·mL-1、8.921 2U·mL-1,均與預測值8.904 1U·mL-1接近,說明該模型能夠較好地預測該菌實際發(fā)酵情況。

        3 討 論

        本研究從印尼熱泉水樣中篩選出的高產耐高溫卡拉膠酶菌株Lc 50-1,初步鑒定為芽孢桿菌屬(Bacillus.sp)。以往研究報道的產卡拉膠酶的菌種多是假單胞菌[12]、弧菌[13]、噬纖維菌[14]等,而對芽孢桿菌屬(Bacillus.sp)產卡拉膠酶的研究尚未見報道。該研究進一步豐富和擴大了現(xiàn)有的卡拉膠酶資源。

        菌株Lc50-1所產的卡拉膠酶具有較高耐熱性和熱穩(wěn)定性,與已報道的卡拉膠酶[15-17]相比具有明顯優(yōu)勢,有望開發(fā)應用于高溫條件的工業(yè)生產中,避免多步反應和副反應過程,可為優(yōu)化工藝流程開辟一條新的途徑。

        與傳統(tǒng)的正交實驗相比,響應面分析法具有周期短、精度高、實驗次數(shù)少等優(yōu)點,不僅能夠評價各因素對生物發(fā)酵過程的影響,并且還能探究幾個因素的交互作用,得到最佳條件,是優(yōu)化培養(yǎng)條件的有效方法。目前,響應面分析法已在生物技術的眾多領域,尤其是微生物產酶條件優(yōu)化方面得到廣泛應用[8-11]。本實驗經響應面法優(yōu)化后所得酶活與預測值較為吻合,從而說明該模型設計的合理有效性,優(yōu)化后發(fā)酵上清液的酶活比未優(yōu)化時提高了1.5倍。影響菌株卡拉膠酶產量和活力的因素,除菌種外,培養(yǎng)基組成和發(fā)酵條件也十分重要。因此,選擇適當?shù)腃源、N源及金屬離子并對其組成進行合理的設計和配制,使其既能滿足產酶微生物生長的需要,也能滿足菌株產酶的需要。本研究采用響應面法對產卡拉膠酶熱泉菌株Lc50-1的培養(yǎng)條件進行了優(yōu)化,有效提高了酶活和產量,從而為高溫卡拉膠酶及卡拉寡糖的開發(fā)利用提供了科學依據(jù)和技術支撐。

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