胡秋實(shí)，蘇忠亮，何培青，李 江

（1.青島科技大學(xué) 化工學(xué)院，青島 山東 266042；2.國(guó)家海洋局 第一海洋研究所，青島 山東 266061）

卡拉膠是紅藻細(xì)胞壁中的一種親水性多糖，是由重復(fù)的α－（1，4）－D－吡喃半乳糖和β－（1，3）－D－吡喃半乳糖二糖單元為基本骨架，交替連接而成的線性硫酸多糖［1］。根據(jù)是否含有3，6內(nèi)醚－D－半乳吡喃糖、硫酸基以及硫酸基在分子中的位置不同，可以將卡拉膠分為十幾種類型，工業(yè)上目前主要使用和生產(chǎn)的有κ－、λ－、ι－三種類型。目前，近80%的卡拉膠用于食品及與食品相關(guān)工業(yè)，其余近20%用于醫(yī)藥、輕工、紡織、化工和化妝品領(lǐng)域。有研究成果表明卡拉膠在醫(yī)藥領(lǐng)域有很大的應(yīng)用價(jià)值而且具有多種生物活性，如抗病毒、抗氧化、抗凝血、免疫調(diào)節(jié)等［2－5］。但由于卡拉膠多糖分子質(zhì)量太大，使得其溶解性差、很難被機(jī)體吸收，嚴(yán)重限制了卡拉膠在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用。相比卡拉膠多糖，卡拉膠寡糖具有較小的相對(duì)分子質(zhì)量，其溶解性、安全性和穩(wěn)定性也都有所增加。因?yàn)閭鹘y(tǒng)的化學(xué)方法和物理降解方法反應(yīng)條件不易控制、產(chǎn)物分布不均勻，所以利用反應(yīng)條件溫和、底物專一的卡拉膠降解酶制備卡拉膠寡糖成為研究的熱點(diǎn)。因此開展對(duì)卡拉膠降解酶的研究具有深遠(yuǎn)的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。

迄今為止，研究發(fā)現(xiàn)的卡拉膠酶多為熱不穩(wěn)定酶，當(dāng)溫度高于60℃時(shí)就會(huì)迅速失活［6］。而來(lái)源于嗜熱微生物的高溫酶因其作用溫度高、熱穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，在多個(gè)生物工程領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用潛能。熱泉是一個(gè)獨(dú)特的生態(tài)環(huán)境，其溫度一般在50℃以上，有些甚至高于100℃，因而生存于此環(huán)境的熱泉菌具有獨(dú)特的適應(yīng)機(jī)制和新穎的代謝產(chǎn)物。近年來(lái)，有關(guān)高溫酶的研究日益廣泛，越來(lái)越多具有潛在應(yīng)用前景的高溫酶被發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用，但有關(guān)高溫卡拉膠酶的研究還未見相關(guān)報(bào)道。

本研究從印尼熱泉中篩選出1株高產(chǎn)卡拉膠酶菌株，初步研究表明該酶的最適酶活高于70℃，具有良好的應(yīng)用前景。本研究采用響應(yīng)面法對(duì)其產(chǎn)酶的發(fā)酵條件和培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化，以提高其產(chǎn)酶量及穩(wěn)定性，從而為該高溫卡拉膠酶的分離純化、酶學(xué)性質(zhì)研究、酶解特性及工業(yè)化應(yīng)用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 菌 種

產(chǎn)卡拉膠酶菌株分離自印尼熱泉水樣，保存于國(guó)家海洋局海洋生物活性物質(zhì)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室超低溫冰箱（－80℃）。

1.1.2 培養(yǎng)基

液體培養(yǎng)基：蛋白胨3g，酵母粉3g，氯化鈉3g，蒸餾水1L；

固體培養(yǎng)基：蛋白胨3g，酵母粉3g，卡拉膠15g，瓊脂粉15g，氯化鈉3g，蒸餾水1L；

斜面培養(yǎng)基：蛋白胨5g，酵母粉1g，瓊脂粉15g，氯化鈉3g，蒸餾水1L。

1.2 方 法

1.2.1 酶活的測(cè)定－DNS法

取0.5mL的酶液加入到1mL的卡拉膠底物（含0.2%卡拉膠的0.2mol·L－1甘氨酸－NaOH緩沖液，pH 9.0）中，70℃反應(yīng)15min，用100℃滅活10min的酶液作對(duì)照；取1mL反應(yīng)物與1.5mL DNS試劑分別加入比色管中，沸水浴中加熱5min，立即冷卻至室溫，定容到25mL，搖勻，于520nm處測(cè)光吸收值；根據(jù)半乳糖標(biāo)準(zhǔn)曲線確定產(chǎn)生還原糖的量。1個(gè)酶活力單位（U）定義為：在該條件下，每分鐘產(chǎn)生1μg還原糖（以 D－半乳糖計(jì)）所需要的酶量［7］。

1.2.2 單因素篩選

將上述液體培養(yǎng)基作為發(fā)酵基本培養(yǎng)基，分別對(duì)接種量、C源、N源、金屬離子、pH值和培養(yǎng)溫度進(jìn)行單因素變量實(shí)驗(yàn)，其他發(fā)酵條件均與液體培養(yǎng)基相同，每組設(shè)置3個(gè)平行對(duì)照用DNS法測(cè)酶活。

1.3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

根據(jù)Plackett－Burman實(shí)驗(yàn)（略）篩選出的4個(gè)顯著性因素，設(shè)計(jì)Box－Behnken試驗(yàn)，根據(jù)設(shè)定參數(shù)進(jìn)行一系列實(shí)驗(yàn)，將實(shí)驗(yàn)結(jié)果輸入 Design－Expert.V8.0.6軟件中。在 Design－Expert.V8.0.6軟件中進(jìn)行二次響應(yīng)面回歸分析并建立回歸模型、方差分析及可信度分析。

根據(jù)回歸方程及相應(yīng)曲面確定最大值點(diǎn)以及其對(duì)應(yīng)的因素的編碼水平，在該水平下進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酶實(shí)驗(yàn)，比較實(shí)際值與預(yù)測(cè)值的差別，驗(yàn)證模型的正確性［8］。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

本研究分別考察了培養(yǎng)溫度、pH值、C源、N源、金屬離子、接種量六種單因素變量對(duì)酶活的影響，結(jié)果表明各種環(huán)境因子對(duì)該菌的生物量（OD600）和酶活都有較顯著的影響。在綜合考慮環(huán)境因子對(duì)生物量和酶活影響的基礎(chǔ)上，初步確定培養(yǎng)溫度為50℃、pH 7.0及培養(yǎng)基成分（卡拉膠0.3%、蛋白胨0.3%、KCl 25 mmol·L－1、NaCl添加量3‰）（圖1）。

2.2 Box－Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

C源通過(guò)Plackett－Burman實(shí)驗(yàn)篩選出了4個(gè)顯著性因素：培養(yǎng)溫度、卡拉膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)、蛋白胨質(zhì)量分?jǐn)?shù)（N源）、KCl濃度，設(shè)計(jì)Box－Behnken實(shí)驗(yàn)，考察了這4個(gè)顯著因素之間的交互作用及最佳取值。對(duì)這4個(gè)顯著因素的水平設(shè)計(jì)及編碼見表1，Box－Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

表1 Box－Behnken實(shí)驗(yàn)因素及水平Table 1 Tested Factors and level values of Box－Behnken test

表2 N＝29的Box－Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Experimental design and results of Box－Behnken test（N＝29）

根據(jù)Box－Behnken實(shí)驗(yàn)結(jié)果（表2），以菌株Lc50－1發(fā)酵液酶活（U·mL－1）為響應(yīng)值利用Design－Expert.V8.0.6軟件進(jìn)行回歸分析，得到二次回歸模型：

Y＝8.7098－0.22867A－0.11517B＋0.18975C－0.044083D＋0.3015AB－1.656AC＋0.993AD－0.87775BC＋0.06725BD－0.264CD－2.21723A2－1.22298B2－0.64511C2－1.34711D2

由回歸方差分析（表3）可知：此模型回歸性顯著，回歸模型的R2＝93.87%，說(shuō)明該模型可以解釋93.87%實(shí)驗(yàn)所得菌株Lc 50－1酶活的變化，從而說(shuō)明該模型與實(shí)際擬合較好，可用于菌株Lc 50－1酶活的分析與預(yù)測(cè)，適合菌株Lc 50－1發(fā)酵產(chǎn)酶條件的優(yōu)化。

表3 回歸方程的方程方差分析Table 3 Variance a Analysis of regression equation

2.3 響應(yīng)面分析及最佳發(fā)酵條件的確定

利用Design－Expert軟件對(duì)回歸模型進(jìn)行響應(yīng)面分析得到6個(gè)響應(yīng)面回歸分析圖（圖2～7），可直觀地反映出各因子的變化對(duì)響應(yīng)值影響。

圖2 Y＝（A，B）的等高線圖及響應(yīng)面立體分析圖Fig.2 Y＝（A，B）contour plot and response surface stereogram

圖3 Y＝（A，C）的等高線圖及響應(yīng)面立體分析圖Fig.3 Y＝（A，C）contour plot and response surface stereogram

圖4 Y＝（A，D）的等高線圖及響應(yīng)面立體分析圖Fig.4 Y＝（A，D）contour plot and response surface stereogram

圖5 Y＝（B，C）的等高線圖及響應(yīng)面立體分析圖Fig.5 Y＝（B，C）contour plot and response surface stereogram

圖6 Y＝（B，D）的等高線圖及響應(yīng)面立體分析圖Fig.6 Y＝（B，D）contour plot and response surface stereogram

圖7 Y＝（C，D）的等高線圖及響應(yīng)面立體分析圖Fig.7 Y＝（C，D）contour plot and response surface stereogram

通過(guò)Design－Expert軟件進(jìn)一步分析預(yù)測(cè)，達(dá)到最高酶活值時(shí)，其所對(duì)應(yīng)的A、B、C、D四個(gè)因素的編碼值分別為－0.49、－0.48、1、－0.31，即培養(yǎng)溫度47.5℃（理論值47.45℃）、蛋白胨0.25%（理論值0.248%）、卡拉膠0.3%、KCl 21.55mmol·L－1（由于實(shí)驗(yàn)室具體條件無(wú)法達(dá)到一些理論值的精確度，故選取與理論值最接近的值），此時(shí)預(yù)測(cè)最大酶活值為8.904U·mL－1。根據(jù)預(yù)測(cè)的最佳條件進(jìn)行3組發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，得出的實(shí)際酶活值為：8.883 2U·mL－1、8.824 3U·mL－1、8.921 2U·mL－1，均與預(yù)測(cè)值8.904 1U·mL－1接近，說(shuō)明該模型能夠較好地預(yù)測(cè)該菌實(shí)際發(fā)酵情況。

3 討 論

本研究從印尼熱泉水樣中篩選出的高產(chǎn)耐高溫卡拉膠酶菌株Lc 50－1，初步鑒定為芽孢桿菌屬（Bacillus.sp）。以往研究報(bào)道的產(chǎn)卡拉膠酶的菌種多是假單胞菌［12］、弧菌［13］、噬纖維菌［14］等，而對(duì)芽孢桿菌屬（Bacillus.sp）產(chǎn)卡拉膠酶的研究尚未見報(bào)道。該研究進(jìn)一步豐富和擴(kuò)大了現(xiàn)有的卡拉膠酶資源。

菌株Lc50－1所產(chǎn)的卡拉膠酶具有較高耐熱性和熱穩(wěn)定性，與已報(bào)道的卡拉膠酶［15－17］相比具有明顯優(yōu)勢(shì)，有望開發(fā)應(yīng)用于高溫條件的工業(yè)生產(chǎn)中，避免多步反應(yīng)和副反應(yīng)過(guò)程，可為優(yōu)化工藝流程開辟一條新的途徑。

與傳統(tǒng)的正交實(shí)驗(yàn)相比，響應(yīng)面分析法具有周期短、精度高、實(shí)驗(yàn)次數(shù)少等優(yōu)點(diǎn)，不僅能夠評(píng)價(jià)各因素對(duì)生物發(fā)酵過(guò)程的影響，并且還能探究幾個(gè)因素的交互作用，得到最佳條件，是優(yōu)化培養(yǎng)條件的有效方法。目前，響應(yīng)面分析法已在生物技術(shù)的眾多領(lǐng)域，尤其是微生物產(chǎn)酶條件優(yōu)化方面得到廣泛應(yīng)用［8－11］。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)響應(yīng)面法優(yōu)化后所得酶活與預(yù)測(cè)值較為吻合，從而說(shuō)明該模型設(shè)計(jì)的合理有效性，優(yōu)化后發(fā)酵上清液的酶活比未優(yōu)化時(shí)提高了1.5倍。影響菌株卡拉膠酶產(chǎn)量和活力的因素，除菌種外，培養(yǎng)基組成和發(fā)酵條件也十分重要。因此，選擇適當(dāng)?shù)腃源、N源及金屬離子并對(duì)其組成進(jìn)行合理的設(shè)計(jì)和配制，使其既能滿足產(chǎn)酶微生物生長(zhǎng)的需要，也能滿足菌株產(chǎn)酶的需要。本研究采用響應(yīng)面法對(duì)產(chǎn)卡拉膠酶熱泉菌株Lc50－1的培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，有效提高了酶活和產(chǎn)量，從而為高溫卡拉膠酶及卡拉寡糖的開發(fā)利用提供了科學(xué)依據(jù)和技術(shù)支撐。

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