馮子明，袁中平，董謝平，鄧 亮，付 旸

（江西省人民醫(yī)院骨科，南昌 330006）

實(shí)體腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移與血管生成密切相關(guān)。目前，大多數(shù)研究者采用CD34等泛血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物檢測(cè)腫瘤新生血管的微血管密度（microvessel density,MVD）［1-4］。本研究采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)CD34抗體轉(zhuǎn)移瘤微血管的分布，探討轉(zhuǎn)移癌微血管表達(dá)的特點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 病例資料

選擇江西省人民醫(yī)院2007年6月至2013年6月手術(shù)切除轉(zhuǎn)移瘤組織標(biāo)本43例 （轉(zhuǎn)移癌組），均經(jīng)病理檢查證實(shí)。其中男27例，女15例，年齡30～77歲，平均49.48歲；鱗癌轉(zhuǎn)移瘤25例，直腸癌轉(zhuǎn)移瘤18例。另選擇同期本院的手術(shù)切除舌鱗癌癌組織標(biāo)本11例（鱗癌組），男6例，女5例，年齡 25～63歲，平均 38.7歲。

1.2 方法

1.2.1 主要儀器與試劑

石蠟切片機(jī) （SLEE,德國(guó)）；0.5～10.0 μL 單道電動(dòng)數(shù)字移液器（Brand，德國(guó)）；微波爐（格蘭仕，廣東）；電熱恒溫箱 PVD-050，上海）；雙筒顯微鏡（Olympus，日本）；顯微照相系統(tǒng)（Nikon,AFX-ⅡA，日本）。鼠抗人單克隆抗體CD34（即用型）、SP免疫組化試劑盒（即用型）及DAB顯色試劑盒均購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司。

1.2.2 CD34染色方法及結(jié)果判定

CD34染色均采用免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)。樣本經(jīng)體積分?jǐn)?shù)為10%中性甲醛溶液中固定，常規(guī)石蠟包埋，4 μm厚切片后，按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作步驟進(jìn)行檢測(cè)。所有切片結(jié)果應(yīng)用數(shù)碼相機(jī)采集圖像，彩色細(xì)胞圖像分析系統(tǒng)計(jì)數(shù)微血管密度（MVD）值。CD34在光學(xué)顯微鏡下將血管內(nèi)皮細(xì)胞染為棕黃色。

1.2.3 MVD的測(cè)定

采用Weidner等［5］提出的方法對(duì)研究結(jié)果進(jìn)行MVD量化分析。首先在40倍光學(xué)顯微鏡視野下掃視整個(gè)切片，尋找血管高密度集中的區(qū)域；在200倍光學(xué)顯微鏡視野下，應(yīng)用顯微照相系統(tǒng)計(jì)數(shù)微血管數(shù)目，各計(jì)數(shù)3個(gè)高倍視野，取其平均值作為該標(biāo)本的MVD數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 14.0統(tǒng)計(jì)分析軟件包對(duì)全部數(shù)據(jù)進(jìn)行組間t檢驗(yàn)及秩和檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

CD34將腫瘤組織微血管標(biāo)本染為棕黃色，在腫瘤組織的微小血管及大血管上表達(dá)均較強(qiáng)，與其他組織分界清楚。轉(zhuǎn)移癌組的標(biāo)本在200光學(xué)顯微鏡視野下，應(yīng)用顯微照相系統(tǒng)計(jì)數(shù)微血管數(shù)目為2～6根；鱗癌組標(biāo)本的微血管數(shù)目為14～19根。見(jiàn)封四圖1—2。轉(zhuǎn)移癌組CD34的表達(dá)明顯低于鱗癌組（P＜0.01）；2組標(biāo)本血管標(biāo)記物標(biāo)記的癌組織MVD值在男女患者間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞0.05）；CD34標(biāo)記的MVD值在不同的轉(zhuǎn)移瘤之間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

表1 CD34標(biāo)記轉(zhuǎn)移瘤、鱗癌MVD的比較 根

3 討論

血管生成是腫瘤生長(zhǎng)、侵襲、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的基礎(chǔ)，腫瘤血管的生成與促血管生成因子、腫瘤細(xì)胞分泌激素及基因調(diào)控等諸多因素有關(guān)，其中血管生長(zhǎng)刺激因子和血管生長(zhǎng)抑制因子作用平衡與否，決定了血管生成是促進(jìn)還是抑制［6］。當(dāng)腫瘤體積增長(zhǎng)＞1～2 mm-3時(shí)，如無(wú)新生血管長(zhǎng)入，腫瘤組織將保持靜止?fàn)顟B(tài)或退化［7］。新生血管長(zhǎng)入腫瘤后血液供應(yīng)豐富,新生血管不僅為腫瘤組織提供足夠的營(yíng)養(yǎng)和氧,還提供大量的生長(zhǎng)因子,促使腫瘤迅速生長(zhǎng)。血管生成也與腫瘤轉(zhuǎn)移有著重要的關(guān)系，因?yàn)槟[瘤新生血管不成熟，結(jié)構(gòu)缺乏完整性和細(xì)胞間連接，管壁薄弱，僅排列一層內(nèi)皮細(xì)胞，缺乏平滑肌，基膜也不完整，因此穿透性較高，腫瘤細(xì)胞容易穿透微血管壁發(fā)生轉(zhuǎn)移；腫瘤新生血管形成后使腫瘤病灶組織間質(zhì)內(nèi)液體量和壓力增高，從而使淋巴回流增加，腫瘤細(xì)胞通過(guò)淋巴管系統(tǒng)轉(zhuǎn)移，亦是促使腫瘤轉(zhuǎn)移的重要影響因素。腫瘤內(nèi)MVD與腫瘤的惡性程度也有密切的關(guān)系，目前原發(fā)腫瘤組織內(nèi)的MVD已成為預(yù)測(cè)腫瘤轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)及判斷預(yù)后的一項(xiàng)重要指標(biāo)。本研究對(duì)轉(zhuǎn)移瘤血管生成進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)原發(fā)癌與轉(zhuǎn)移瘤在血管生成有明顯差異，轉(zhuǎn)移瘤血管形成較原發(fā)腫瘤明顯減少（P＜0.01）。

腫瘤血管生成與缺氧有明顯的關(guān)系，缺氧是實(shí)體性腫瘤物理微環(huán)境的基本特征之一。腫瘤生長(zhǎng)速度快，腫瘤細(xì)胞大量生長(zhǎng)需氧量增加，當(dāng)氧的需求超過(guò)供給，并且因腫瘤組織快速生長(zhǎng)間質(zhì)內(nèi)壓力增高，使腫瘤內(nèi)不成熟的血管塌陷，腫瘤病灶微環(huán)境缺氧加重；缺氧將刺激腫瘤細(xì)胞和宿主細(xì)胞合成分泌多種促血管生成因子，促進(jìn)局部新生血管形成；缺氧還通過(guò)缺氧誘導(dǎo)因子1（hypoxia induced factor-1,HIF-1）上調(diào)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子 （vascular endothelial growth factor，VEGF）及其受體的表達(dá)［8-9］。

目前的研究［10］認(rèn)為，與腫瘤血管生成相關(guān)的基因主要有Rac-1、p53及PTEN。Rac-1是Rho家族蛋白中的一個(gè)分子，Rho GTPases是一組相對(duì)分子量為20000～25000的單體鳥(niǎo)苷酸結(jié)合蛋白，屬小G蛋白家族。Rac-1在缺氧狀況下促進(jìn)HIF-1的活化，并且加強(qiáng)HIF-1的轉(zhuǎn)錄活性和蛋白表達(dá)。同時(shí)還發(fā)現(xiàn) Rac-1可調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）和VEGF誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的趨化作用，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、運(yùn)動(dòng)和遷移，是VEGF后信號(hào)通路的一個(gè)重要中間分子。因此，目前認(rèn)為Rac-1可能也是血管生成過(guò)程中的一個(gè)重要的調(diào)控因子［10］。

p53可以抑制腫瘤血管生成，其的缺失或突變可導(dǎo)致腫瘤血管增生明顯。p53的作用機(jī)制主要是通過(guò)泛素介導(dǎo)的蛋白水解作用，降解HIF－1α，從而抑制 HIF－1α 介導(dǎo)的血管生成［11－12］。有學(xué)者［13－14］研究發(fā)現(xiàn)，隨著腫瘤組織細(xì)胞缺氧時(shí)間的延長(zhǎng)，p53表達(dá)水平出現(xiàn)逐漸下降的趨勢(shì)，而與VEGF表達(dá)的上升呈現(xiàn)相反趨勢(shì)。因此，增強(qiáng)p53基因的表達(dá)可以抑制腫瘤血管的生成。

近年來(lái)的研究［14］認(rèn)為，人第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因（PTEN）是與腫瘤血管生成有關(guān)的基因，位于染色體10 q23.3，編碼一雙特異性的磷酸酶，起抑制調(diào)控PI3K2AKT，導(dǎo)致細(xì)胞周期的停滯和凋亡。隨著腫瘤組織缺氧時(shí)間的延長(zhǎng)，PTEN蛋白的表達(dá)出現(xiàn)逐漸下降趨勢(shì)，而與VEGF表達(dá)的上升呈現(xiàn)相反趨勢(shì)。Jiang等［15］的研究也發(fā)現(xiàn)，PTEN高表達(dá)可抑制雞尿囊胚血管生成，并通過(guò)PI3K2AKT途徑抑制VEGF的表達(dá)。

腫瘤血管生成的過(guò)程是腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞產(chǎn)生的具有相反作用的血管生成因子不平衡作用的結(jié)果。目前，在人類(lèi)腫瘤血管生成方面的研究中，檢測(cè)腫瘤血管生成是通過(guò)測(cè)定MVD來(lái)實(shí)現(xiàn)的，通過(guò)血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物進(jìn)行測(cè)量是公認(rèn)的能夠代表腫瘤血管生成狀態(tài)的方法。研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物主要有 CD31、CD34、Tie2、E9 及TEC等［16］。本研究采用CD34作為腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物檢測(cè)腫瘤新生血管的MVD，轉(zhuǎn)移癌組微血管數(shù)目為2～6根；鱗癌組標(biāo)本的微血管數(shù)目為14～19根。應(yīng)用SPSS14.0統(tǒng)計(jì)分析軟件包對(duì)全部數(shù)據(jù)進(jìn)行組間t檢驗(yàn)及秩和檢驗(yàn)，轉(zhuǎn)移癌組CD34的表達(dá)明顯低于鱗癌組（P＜0.01）；血管標(biāo)記物標(biāo)記的癌組織MVD值在男、女患者間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），CD34 標(biāo)記的 MVD 值在不同的轉(zhuǎn)移瘤之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。如果對(duì)轉(zhuǎn)移瘤血管在血管生成因子，腫瘤血管生成相關(guān)基因Rac－1、p53及PTEN的表達(dá)等方面進(jìn)行研究可能會(huì)有更多的新發(fā)現(xiàn)。

［1］Hasan J，Shnyder S D，Bibby M,et al.Quantitative angiogenesis assays in vivo－a review［J］.Angiogenesis，2004，7（1）:1－16.

［2］Shivakumar S，Prabhakar B T，Jayashree K，et al.Evaluation of serum vascular endothelial growth factor（VEGF）and microvessel density（MVD）as prognostic indicators in carcinoma breast［J］.J Cancer Res Clin Oncol，2009，135，（4）:627－636.

［3］Benckert C,Thelen A,Cramer T,et al.Impact of microvessel density on lymph node metastasis and survival after curative resection of pancreatic cancer［J］.Surgery Today,2012,42（2）:169－176.

［4］Hansen T F,Sorensen F B,Spindler K L,et al.Microvessel density and the association with single nucleotide polymorphisms of the vascular endothelial growth factor receptor 2 in patients with colorectal cancer［J］.Virchows Archiv,2010,456（3）:251－260.

［5］Weidner N,Semple J P,Welch W R,et al.Tumor angiogenesis and metastasis－correlation in invasive breast carcinoma［J］.N Engl J Med,1991,324（1）:1－8.

［6］Ferrara N,Gerber H P,Couter J.The biology of VEGF and its receptors［J］.Nat Med,2003,9（6）:669－676.

［7］Nesbit M.Abrogation of tumor vasculature using gene therapy［J］.Cancer Metastasis Rev,2000,19 （1/2）:45－49.

［8］Folkman J.Role of angiogensis in tumor growth and metastasis ［J］.Semin Oncol,2002,29（6 S16）:15－18.

［9］Nyberg P,Xie L,Kalluri R.Endogenous inhibitors of angiogensis［J］.Cancer Res,2005,65（10）:3967－3979.

［10］薛妍,畢鋒,劉文超,等.缺氧狀況下 Rho GTPases的表達(dá)和活性變化及其與腫瘤血管生成關(guān)系的研究［J］.中華腫瘤雜志,2004,26（9）:517－520.

［11］Matsubara T,Funabiki T,Jinno O,et al.p53 Gene mutations and overexpression of p53 product in cancerous and noncancerous biliary epithelium in patients with pancreaticobiliary maljunction［J］.J Hepatobiliary Pancreat Surg,1999,6（3）:286－293.

［12］Biesaga B,Niemiec J,Ziobro M.Microvessel density and status of p53 protein as potential prognostic factors for adjuvant anthracycline chemotherapy in retrospective analysis of early breast cancer patients group ［J］.Pathol Oncol Res,2012,18（4）:949－960.

［13］Breier G,Blum S,Peli J,et al.Transforming growth factor2beta and Ras regulate the VEGF/VEGF2receptor system during tumor angiogenesis［J］.Cancer,2002,97（2）:142－148.

［14］Ravi R,Mookerjee B,Bhuj walla Z M,et al.Regulation of tumor angiogenesis by p53－induced degradation of hypoxia－inducible factor 1alpha［J］.Genes Dev,2000,14（1）:34－44.

［15］Jiang B H,Zheng J Z,Aoki M,et al.Phosphatidylinositol 3－kinase signaling mediates angiogenesis and expression of vascular endothelial growth factor in endothelialcells［J］.ProcNatlAcadSciUSA,2000,97（4）:1749－1753.

［16］Miyata Y,Sagara Y,Watanabe S,et al.CD105 is a more appropriate marker for evaluating angiogenesis in urothelial cancer of the upper urinary tract than CD31 or CD34［J］.Virchows Archiv,2013,463,（5）:673－679.