劉迪群，吳雪艷，鐘 華

（南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科，湖南 衡陽 421001）

結(jié)腸癌是我國最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，其發(fā)病率位居第二位，僅次于胃癌，且近年呈現(xiàn)年輕化及上升趨勢。轉(zhuǎn)移作為惡性腫瘤的重要生物學(xué)特性之一，是涉及到多種生物分子參與的復(fù)雜過程，直接關(guān)系到腫瘤的分級及分期。目前由于腫瘤患者早期檢出率低，大部分患者明確診斷時(shí)已發(fā)生轉(zhuǎn)移，錯(cuò)過了手術(shù)治療的最佳時(shí)期。作為腫瘤的輔助治療方式之一，放射治療對改善患者的5年生存率無明顯意義［1］。因此，早期診斷結(jié)腸癌對提高患者的生存率至關(guān)重要。Kiss-1是繼nm23之后，由Lee等［2］應(yīng)用微細(xì)胞介導(dǎo)的染色體雜交技術(shù)及差減雜交技術(shù)在人黑色素瘤細(xì)胞株中發(fā)現(xiàn)的一種腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因，其定位于染色體1q32-q41，基因序列中包含4個(gè)外顯子，編碼的蛋白kisspeptin是由145個(gè)氨基酸組成的親水性多肽。有研究［3］表明Kiss-1基因與人黑色素瘤、膀胱癌、乳腺癌及腎細(xì)胞癌的轉(zhuǎn)移能力呈負(fù)相關(guān)，直接影響著腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移。本研究在體外構(gòu)建高表達(dá)Kiss-1的結(jié)腸癌SW480細(xì)胞株，旨在探討Kiss-1基因?qū)Y(jié)腸癌增殖的影響，為結(jié)腸癌患者創(chuàng)造新的治療靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480由湘雅醫(yī)學(xué)院腫瘤研究所惠贈；質(zhì)粒pEGFP-N1-Kiss-1及空載質(zhì)粒由上海吉?jiǎng)P公司合成，2種質(zhì)粒均含有GFP綠色熒光，經(jīng)測序鑒定無誤；質(zhì)粒小提試劑盒為康為公司產(chǎn)品，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒Lipofectamine2000購自美國invitrogen公司，G418及CCK8試劑盒購自北京索萊寶生物科技有限公司，兔抗人Kiss-1一抗購自武漢博士德生物工程有限公司、二抗購自美國Epitomics公司。

1.2 質(zhì)粒擴(kuò)增與提取

LB肉湯2.5 g加入100 mL一級水中配置成25 mg·mL-1的LB液態(tài)培養(yǎng)基，高溫蒸汽消毒備用。培養(yǎng)基中加入卡那霉素，使其終濃度為30 μg·mL-1。質(zhì)粒pEGFP-N1-Kiss-1及空載質(zhì)粒各100 μL分別加入 5 mL LB 培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r·min-1震蕩 16 h。提取純化質(zhì)粒并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳及分光光度計(jì)測量質(zhì)粒濃度。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)、分組與轉(zhuǎn)染

將人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480培養(yǎng)于含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基中，置于37℃，5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞生長至90%～95%融合度時(shí)將其隨機(jī)分為3組。1）空白對照組未進(jìn)行轉(zhuǎn)染。2）實(shí)驗(yàn)組用pEGFP-N1-Kiss-1進(jìn)行轉(zhuǎn)染:用無血清1640培養(yǎng)基將 8 μg pEGFP-N1-Kiss-1 質(zhì)粒和 10 μL Lipofectamine2000分別稀釋至總體積為250 μL，室溫下靜置5 min；輕輕混勻2種溶液，室溫下靜置20 min，將混合液加入SW480細(xì)胞中，37℃，5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h；吸去培養(yǎng)基，PBS液洗2遍，加入含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基終止轉(zhuǎn)染；42 h 后更換完全培養(yǎng)基，加入 500 μg·mL-1G418篩選，培養(yǎng)3～4 d待細(xì)胞大量死亡時(shí)，降低濃度至300 μg·mL-1維持篩選4周左右，獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞。3）陰性對照組用空載體pEGFP-N1進(jìn)行轉(zhuǎn)染，方法同實(shí)驗(yàn)組。

1.4 Western-blot鑒定Kiss-1在SW480細(xì)胞中的表達(dá)

分別提取空白對照組、陰性對照組及實(shí)驗(yàn)組中SW480細(xì)胞總蛋白，用BCA試劑盒測定各組樣本蛋白濃度，用15%SDS聚丙烯酰胺凝膠跑電泳，每孔上樣蛋白量為30 μg，半干轉(zhuǎn)至 PVDF膜，麗春紅染色驗(yàn)證后用含5%血清的TBST封閉，依次結(jié)合對應(yīng)一抗及辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，最后暗室曝光顯像，檢測Kiss-1表達(dá)的變化。

1.5 CCK8法檢測細(xì)胞增殖情況

已處對數(shù)生長期的各組細(xì)胞用0.25%胰酶消化，制成細(xì)胞懸液接種于 96孔板內(nèi)（2×103孔-1）定容至100 μL培養(yǎng)，每組細(xì)胞設(shè)3個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置3個(gè)空白孔（只含細(xì)胞培養(yǎng)基）。分別于0、24、48及72 h每孔加入5 μL CCK-8溶液，5%CO2及飽和濕度培養(yǎng)基繼續(xù)孵育2 h，檢測450 nm光譜下的吸光度，根據(jù)每天吸光值的均數(shù)繪制細(xì)胞生長曲線。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 SW480細(xì)胞轉(zhuǎn)染質(zhì)粒及篩選

SW480細(xì)胞轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后24 h，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞，可見綠色熒光。經(jīng)過4周的G418篩選，G418 維持濃度為 300 μg·mL-1，視野里幾乎所有細(xì)胞都帶有綠色熒光蛋白。停用G4181周，熒光顯微鏡下觀察綠色熒光基本保持不變。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株篩選成功。

2.2 Kiss-1在SW480細(xì)胞中的表達(dá)

Kiss-1在空白對照組、陰性對照組與實(shí)驗(yàn)組中的表達(dá)見圖1，結(jié)果顯示:Kiss－1在實(shí)驗(yàn)組中高表達(dá)，而在空白對照組及陰性對照組中低表達(dá)，3組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)果提示，Kiss－1 基因在SW480－Kiss－1細(xì)胞中能穩(wěn)定、高效地表達(dá)。

圖1 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后Western－blot檢測Kiss－1在SW480細(xì)胞中的表達(dá)

2.3 Kiss-1對SW480細(xì)胞增殖的影響

3組培養(yǎng)各時(shí)段SW480細(xì)胞數(shù)比較見表1，3組SW480細(xì)胞生長曲線見圖2。結(jié)果顯示:培養(yǎng)0、24 h時(shí)各組SW480細(xì)胞數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），48 h 后，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長，實(shí)驗(yàn)組 SW480細(xì)胞數(shù)明顯低于空白對照組與陰性對照組（P＜0.05），而空白對照組與陰性對照組SW480細(xì)胞數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。 結(jié)果提示，Kiss－1 可抑制SW480細(xì)胞的增殖。

表1 3組培養(yǎng)各時(shí)段SW480細(xì)胞數(shù)比較 ，×104個(gè)

表1 3組培養(yǎng)各時(shí)段SW480細(xì)胞數(shù)比較 ，×104個(gè)

﹡P＜0.05 與實(shí)驗(yàn)組比較。

組別 n 0 h 24 h 48 h 72 h實(shí)驗(yàn)組 3 1.16±0.07 1.62±0.16 2.61±0.14 3.62±0.01空白對照組 3 1.12±0.06 2.28±0.19 4.53±0.46*6.52±0.49*陰性對照組 3 1.10±0.05 2.19±0.11 4.22±0.45*6.21±0.30*

圖2 3組SW480細(xì)胞生長曲線

3 討論

腫瘤轉(zhuǎn)移是一個(gè)涉及到腫瘤細(xì)胞與宿主細(xì)胞相互作用的多級過程。腫瘤細(xì)胞從原發(fā)腫瘤中分離，經(jīng)血循環(huán)及淋巴循環(huán)系統(tǒng)轉(zhuǎn)移至遠(yuǎn)處，黏附于內(nèi)皮細(xì)胞、分解基質(zhì)、外滲，最終在轉(zhuǎn)移部位無限制增殖，導(dǎo)致轉(zhuǎn)移性腫瘤發(fā)生［4］。多種癌基因與抑癌基因參與腫瘤的發(fā)生與發(fā)展過程。Kiss－1是近來頗受關(guān)注的一種腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因，其在多種人體組織中發(fā)揮轉(zhuǎn)移抑制作用［5］。它的基因結(jié)構(gòu)由4個(gè)外顯子區(qū)域組成，外顯子Ⅰ與外顯子Ⅱ?yàn)榉蔷幋a區(qū)，外顯子Ⅲ的結(jié)構(gòu)依次為翻譯起始位點(diǎn)、38個(gè)非編碼堿基及103個(gè)編碼堿基，外顯子Ⅳ含335個(gè)翻譯堿基、翻譯終止點(diǎn)、多腺苷酸化信號和121個(gè)非編碼堿基［3］。Kisspeptin作為一種145個(gè)氨基酸殘基組成的親水性多肽進(jìn)一步水解成多種小分子多肽，其中一種水解產(chǎn)物kisspeptin－54又名metastin，是G－蛋白偶聯(lián)受體的配體。Ringel等［6］發(fā)現(xiàn)Metastin及其受體有著調(diào)節(jié)甲狀腺癌細(xì)胞生物學(xué)活性的作用。在轉(zhuǎn)移性膀胱癌組織中，Kiss－1的表達(dá)水平明顯低于淺表膀胱癌［7］。研究表明相對于Kiss－1高水平表達(dá)的胃癌患者，低表達(dá)患者更容易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，且其死亡率明顯增高［8］。 可見，Kiss－1 表達(dá)水平高者，腫瘤發(fā)展慢，預(yù)后好。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Kiss－1重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞后，SW480細(xì)胞的體外增殖能力從細(xì)胞周期的48 h開始明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此，推測Kiss－1基因能有效抑制結(jié)腸癌SW480細(xì)胞的增殖能力，從而影響結(jié)腸癌的發(fā)展。但其具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究證明，以便為今后結(jié)腸癌患者的早期診斷及靶向基因治療提供理論依據(jù)。

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