頡曉勇，鐘金香，李思發(fā)

（1. 中國水產(chǎn)科學研究院南海水產(chǎn)研究所，廣東省漁業(yè)生態(tài)環(huán)境重點實驗室，廣東 廣州510300；2. 廣東省水產(chǎn)技術推廣總站，廣東 廣州 510220；3.上海海洋大學，上海 201306）

線粒體DNA（Mitochondrial DNA,mtDNA）位于細胞核之外，以非孟德爾遺傳方式控制和影響線粒體功能。由于動物mtDNA 堿基替換速率相對較快，比核內(nèi)堿基有更高的變異，其高效的單倍體母系遺傳方式可縮減用于檢測的有效種群大小，提高對遺傳漂變的敏感性[1]。mtDNA 標記已經(jīng)被廣泛應用于魚類群體遺傳結(jié)構和系統(tǒng)演化關系的相關研究[2-3]。細胞色素b 基因（Cytb）是線粒體13個蛋白質(zhì)編碼基因中應用得最廣泛的基因[4]?？刂茀^(qū)（D-loop）序列是整個mtDNA 序列和長度變異最大的區(qū)域[5]。Cytb 和D-loop 序列應用于群體遺傳結(jié)構和系統(tǒng)進化有大量文獻報道[5-6]。然而，有關Cytb 和D-loop 序列應用于群體遺傳結(jié)構研究結(jié)果之間區(qū)別和聯(lián)系的研究報道相對較少。吉富羅非魚由上海水產(chǎn)大學引進中國之后，經(jīng)歷約10 a 的遺傳改良，成為生產(chǎn)性狀優(yōu)良的養(yǎng)殖新品系[6]。該研究開展了新吉富羅非魚基于mtDNA Cytb 和D-loop 基因序列的群體遺傳結(jié)構對比分析，旨在探索2種分子標記分析結(jié)果的差異與關系，進而為針對不同研究材料，選擇不同的分析方法，以及擴大研究結(jié)果之間橫向比較提供技術上的指導，使得研究結(jié)論更加客觀和真實。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

中國的吉富品系羅非魚由菲律賓引進?；A群體（F0）是1994年引進的5 000 尾尼羅羅非魚，從1996年起按照系統(tǒng)選育方法，人工選育每年產(chǎn)生一代。本試驗的材料是從當初引進的基礎群體F0、選育群體F6～F9共5 代中隨機采樣各20 尾，編號后剪取尾鰭以95%乙醇分別保存。

1.2 基因組DNA 提取

參照常規(guī)的酚－氯仿抽提方法提取尾鰭樣品中的基因組DNA，通過瓊脂糖凝膠電泳方法檢查所提取DNA 質(zhì)量并初步定量。

1.3 PCR 擴增

控制區(qū)擴增所采用的引物參考Jean 等[7]，引物序列為DL1：5’ACC CCT GGC TCC CAA AGC 3’和DH2：5’ATC TTA GCA TCT TCA GTG 3’。細胞色素b 基因所用引物參考彭作剛等[8]，引物序列為L14724：5’GAC TTG AAA AAC CAC CGT TG 3’和H15915：5’CTC TCT CCG GAT TAC AAG AC 3’。PCR 反應體系為50 μL，其中包含10×Buffer 溶液5 μL，dNTP 10 mmol，上游引物20 pmol，下游引物20 pmol，模板DNA 200 ng，Taq DNA 聚合酶2.5 U，不足部分用去離子滅菌水補充至反應體系總體積50 μL。所采用的PCR 擴增反應條件：94℃模板預變性4 min；94℃模板DNA 變性30 s，模板與引物退火30 s，模板- 引物結(jié)合物于72℃延伸1 min，每次擴增包含35個循環(huán)；最后72℃延伸10 min；擴增完成后于4℃保存。其中，控制區(qū)退火溫度50℃，細胞色素b 基因退火溫度56℃。

1.4 DNA 測序

擴增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳進行質(zhì)量檢測，選擇擴增效果好的PCR 產(chǎn)物采用DNA 純化試劑盒進行純化，委托上海生工生物工程技術服務有限公司用ABI 377 DNA 自動測序儀進行擴增片段堿基序列的雙向測定。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

在GenBank 數(shù)據(jù)庫中，用BLAST 軟件[9]搜索尼羅羅非魚Cytb 和D-loop 基因序列，與本研究委托測序所得到的不同選育群體序列結(jié)果進行比較；對測序結(jié)果采用Bioedit 軟件[10]進行編輯，采用CLUSTL W 軟件[11]進行堿基順序重排和DNA 序列同源性比較，同時進行人工核對校正確保DNA 序列結(jié)果的準確性。用DNASP軟件[12]進行堿基序列統(tǒng)計相關分析。用Arlequin 軟件[13]對整理重排確定的DNA 序列進行分子方差分析，同時采用該軟件計算群體遺傳分化指數(shù)Fst，其中Fst 的顯著性采用排列測驗法（Permutation test）進行檢驗（重復次數(shù)為1 000）。遺傳距離采用MEGA 軟件[14]基于Kimura 2-parameter 模型進行計算。按Cytb/D-loop 分別計算由Cytb 和D-loop 2種方法所得到的群體間遺傳距離比率和群體間遺傳分化指數(shù)比率。

2 結(jié)果與分析

2.1 基于Cytb 與D-loop 序列分析的群體內(nèi)遺傳距離比率

本研究基于Cytb 與D-loop 序列分析得到的群體內(nèi)遺傳距離比率結(jié)果如表1 所示。根據(jù)2種方法得到的群體內(nèi)遺傳距離比率范圍0.754 67～0.872 81，平均值0.795 15±0.048 57。

2.2 基于Cytb 與D-loop 序列分析的群體間遺傳分化指數(shù)比率

本研究基于Cytb 與D-loop 序列分析得到群體間遺傳分化指數(shù)比率結(jié)果如表2 所示。根據(jù)2種方法得到的群體間遺傳分化指數(shù)比率范圍為1.051 40～2.914 65，平均值為1.506 55±0.564 65。

3 小結(jié)與討論

表1 基于Cytb 和D-loop 序列的羅非魚5個選育群體間遺傳距離比率

表2 基于Cytb 和D-loop 序列的羅非魚5個選育群體間遺傳分化指數(shù)比率

魚類線粒體DNA 是細胞核外具自主復制、轉(zhuǎn)錄和翻譯能力的遺傳因子，其分子結(jié)構包括一條重鏈、一條輕鏈，呈共價閉合環(huán)狀。mtDNA 在遺傳方式上，遵從母系遺傳，一般不發(fā)生重組。但是mtDNA 的遺傳并不完全獨立，在一定程度上受到核基因的影響和控制，其復制、轉(zhuǎn)錄等過程所需要的各種蛋白酶體系都由核基因編碼。與核DNA 相比，魚類mtDNA 具有分子量小、堿基堆疊方式相對簡單、進化速度相對較快而且其中不同區(qū)段的進化速度存在差異等特點，因而成為細胞內(nèi)一個相對獨立的遺傳信息復制單位。細胞中mtDNA 的堿基突變會導致一個細胞中同時存在兩種類型mtDNA，即形成異質(zhì)性細胞，這種類型的細胞在連續(xù)分裂過程中會改變突變型和野生型的比例。因此，在對群體進行嚴謹?shù)姆肿舆z傳結(jié)構特征分析時，有必要考慮核DNA 與mtDNA的遺傳差異，選擇合適的mtDNA 區(qū)域進行遺傳變異分析。有大量采用Cytb 序列、D-loop 序列或其他mtDNA基因區(qū)域進行分析的研究報道[5,15-16]。mtDNA 不同區(qū)域的進化速率不同，采用mtDNA 不同區(qū)域分析得到的群體遺傳結(jié)構特征必然有所差異，對于mtDNA 不同區(qū)域遺傳得到的群體遺傳結(jié)構特征進行比較和量化分析有助于進一步深入理解群體之間的遺傳結(jié)構特征差異。

當前大多數(shù)采用Cytb 或（和）D-loop 分子標記的研究停留于分析不同種類生物群體的遺傳結(jié)構特征，未對Cytb 和D-loop 研究結(jié)果進一步對比分析，在一定程度上限制了研究結(jié)果的參考和應用價值。該研究基于Cytb方法所得到的群體間遺傳距離均小于基于D-loop 標記所得到的相應遺傳距離，表明D-loop 區(qū)域序列堿基變異速率大于Cytb 區(qū)域，D-loop 標記相對于Cytb 標記具有更高的區(qū)分能力，這一結(jié)論與其他類似研究結(jié)論相一致[17-19]。該研究Cytb 方法所得到的群體間遺傳距離僅為基于D-loop 標記所得到相應遺傳距離的0.795 15，D-loop 標記所得群體間遺傳距離是Cytb 方法所得相應遺傳距離的約1.25 倍。群體遺傳分化指數(shù)是群體遺傳結(jié)構的另一項重要考量指標[6]。根據(jù)楊慧榮等[20]研究赤眼鱒的資料，采用Cytb 與D-loop 方法的群體間Fst 比值與本研究呈現(xiàn)相似的規(guī)律，基于Cytb 的遺傳分化指數(shù)在程度上大于D-loop 的遺傳分化指數(shù)，剔除其Fst 偏離較大及出現(xiàn)負值的情況，可比的Cytb/D-loop 比率范圍在1.172 03～1.283 45 之間。該研究根據(jù)2種方法得到的群體間遺傳分化指數(shù)比率范圍1.051 40～2.914 65，平均值1.506 55，即基于Cytb 的遺傳分化指數(shù)約為D-loop 方法所得遺傳分化指數(shù)的1.5 倍。本研究遺傳距離比率和遺傳分化指數(shù)比率結(jié)果可為其他采用單種Cytb 或D-loop標記方法研究對像遺傳結(jié)構特征提供參考。這同時也表明，采用DNA 不同區(qū)域、不同分子標記方法聯(lián)合分析結(jié)果將更為客觀。

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