頡曉勇，鐘金香，李思發(fā)

（1. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所，廣東省漁業(yè)生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州510300；2. 廣東省水產(chǎn)技術(shù)推廣總站，廣東 廣州 510220；3.上海海洋大學(xué)，上海 201306）

線粒體DNA（Mitochondrial DNA,mtDNA）位于細(xì)胞核之外，以非孟德爾遺傳方式控制和影響線粒體功能。由于動(dòng)物mtDNA 堿基替換速率相對(duì)較快，比核內(nèi)堿基有更高的變異，其高效的單倍體母系遺傳方式可縮減用于檢測(cè)的有效種群大小，提高對(duì)遺傳漂變的敏感性[1]。mtDNA 標(biāo)記已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于魚類群體遺傳結(jié)構(gòu)和系統(tǒng)演化關(guān)系的相關(guān)研究[2-3]。細(xì)胞色素b 基因（Cytb）是線粒體13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因中應(yīng)用得最廣泛的基因[4]。控制區(qū)（D-loop）序列是整個(gè)mtDNA 序列和長(zhǎng)度變異最大的區(qū)域[5]。Cytb 和D-loop 序列應(yīng)用于群體遺傳結(jié)構(gòu)和系統(tǒng)進(jìn)化有大量文獻(xiàn)報(bào)道[5-6]。然而，有關(guān)Cytb 和D-loop 序列應(yīng)用于群體遺傳結(jié)構(gòu)研究結(jié)果之間區(qū)別和聯(lián)系的研究報(bào)道相對(duì)較少。吉富羅非魚由上海水產(chǎn)大學(xué)引進(jìn)中國(guó)之后，經(jīng)歷約10 a 的遺傳改良，成為生產(chǎn)性狀優(yōu)良的養(yǎng)殖新品系[6]。該研究開展了新吉富羅非魚基于mtDNA Cytb 和D-loop 基因序列的群體遺傳結(jié)構(gòu)對(duì)比分析，旨在探索2種分子標(biāo)記分析結(jié)果的差異與關(guān)系，進(jìn)而為針對(duì)不同研究材料，選擇不同的分析方法，以及擴(kuò)大研究結(jié)果之間橫向比較提供技術(shù)上的指導(dǎo)，使得研究結(jié)論更加客觀和真實(shí)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

中國(guó)的吉富品系羅非魚由菲律賓引進(jìn)?；A(chǔ)群體（F0）是1994年引進(jìn)的5 000 尾尼羅羅非魚，從1996年起按照系統(tǒng)選育方法，人工選育每年產(chǎn)生一代。本試驗(yàn)的材料是從當(dāng)初引進(jìn)的基礎(chǔ)群體F0、選育群體F6～F9共5 代中隨機(jī)采樣各20 尾，編號(hào)后剪取尾鰭以95%乙醇分別保存。

1.2 基因組DNA 提取

參照常規(guī)的酚－氯仿抽提方法提取尾鰭樣品中的基因組DNA，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳方法檢查所提取DNA 質(zhì)量并初步定量。

1.3 PCR 擴(kuò)增

控制區(qū)擴(kuò)增所采用的引物參考Jean 等[7]，引物序列為DL1：5’ACC CCT GGC TCC CAA AGC 3’和DH2：5’ATC TTA GCA TCT TCA GTG 3’。細(xì)胞色素b 基因所用引物參考彭作剛等[8]，引物序列為L(zhǎng)14724：5’GAC TTG AAA AAC CAC CGT TG 3’和H15915：5’CTC TCT CCG GAT TAC AAG AC 3’。PCR 反應(yīng)體系為50 μL，其中包含10×Buffer 溶液5 μL，dNTP 10 mmol，上游引物20 pmol，下游引物20 pmol，模板DNA 200 ng，Taq DNA 聚合酶2.5 U，不足部分用去離子滅菌水補(bǔ)充至反應(yīng)體系總體積50 μL。所采用的PCR 擴(kuò)增反應(yīng)條件：94℃模板預(yù)變性4 min；94℃模板DNA 變性30 s，模板與引物退火30 s，模板- 引物結(jié)合物于72℃延伸1 min，每次擴(kuò)增包含35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min；擴(kuò)增完成后于4℃保存。其中，控制區(qū)退火溫度50℃，細(xì)胞色素b 基因退火溫度56℃。

1.4 DNA 測(cè)序

擴(kuò)增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)，選擇擴(kuò)增效果好的PCR 產(chǎn)物采用DNA 純化試劑盒進(jìn)行純化，委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司用ABI 377 DNA 自動(dòng)測(cè)序儀進(jìn)行擴(kuò)增片段堿基序列的雙向測(cè)定。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

在GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中，用BLAST 軟件[9]搜索尼羅羅非魚Cytb 和D-loop 基因序列，與本研究委托測(cè)序所得到的不同選育群體序列結(jié)果進(jìn)行比較；對(duì)測(cè)序結(jié)果采用Bioedit 軟件[10]進(jìn)行編輯，采用CLUSTL W 軟件[11]進(jìn)行堿基順序重排和DNA 序列同源性比較，同時(shí)進(jìn)行人工核對(duì)校正確保DNA 序列結(jié)果的準(zhǔn)確性。用DNASP軟件[12]進(jìn)行堿基序列統(tǒng)計(jì)相關(guān)分析。用Arlequin 軟件[13]對(duì)整理重排確定的DNA 序列進(jìn)行分子方差分析，同時(shí)采用該軟件計(jì)算群體遺傳分化指數(shù)Fst，其中Fst 的顯著性采用排列測(cè)驗(yàn)法（Permutation test）進(jìn)行檢驗(yàn)（重復(fù)次數(shù)為1 000）。遺傳距離采用MEGA 軟件[14]基于Kimura 2-parameter 模型進(jìn)行計(jì)算。按Cytb/D-loop 分別計(jì)算由Cytb 和D-loop 2種方法所得到的群體間遺傳距離比率和群體間遺傳分化指數(shù)比率。

2 結(jié)果與分析

2.1 基于Cytb 與D-loop 序列分析的群體內(nèi)遺傳距離比率

本研究基于Cytb 與D-loop 序列分析得到的群體內(nèi)遺傳距離比率結(jié)果如表1 所示。根據(jù)2種方法得到的群體內(nèi)遺傳距離比率范圍0.754 67～0.872 81，平均值0.795 15±0.048 57。

2.2 基于Cytb 與D-loop 序列分析的群體間遺傳分化指數(shù)比率

本研究基于Cytb 與D-loop 序列分析得到群體間遺傳分化指數(shù)比率結(jié)果如表2 所示。根據(jù)2種方法得到的群體間遺傳分化指數(shù)比率范圍為1.051 40～2.914 65，平均值為1.506 55±0.564 65。

3 小結(jié)與討論

表1 基于Cytb 和D-loop 序列的羅非魚5個(gè)選育群體間遺傳距離比率

表2 基于Cytb 和D-loop 序列的羅非魚5個(gè)選育群體間遺傳分化指數(shù)比率

魚類線粒體DNA 是細(xì)胞核外具自主復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯能力的遺傳因子，其分子結(jié)構(gòu)包括一條重鏈、一條輕鏈，呈共價(jià)閉合環(huán)狀。mtDNA 在遺傳方式上，遵從母系遺傳，一般不發(fā)生重組。但是mtDNA 的遺傳并不完全獨(dú)立，在一定程度上受到核基因的影響和控制，其復(fù)制、轉(zhuǎn)錄等過(guò)程所需要的各種蛋白酶體系都由核基因編碼。與核DNA 相比，魚類mtDNA 具有分子量小、堿基堆疊方式相對(duì)簡(jiǎn)單、進(jìn)化速度相對(duì)較快而且其中不同區(qū)段的進(jìn)化速度存在差異等特點(diǎn)，因而成為細(xì)胞內(nèi)一個(gè)相對(duì)獨(dú)立的遺傳信息復(fù)制單位。細(xì)胞中mtDNA 的堿基突變會(huì)導(dǎo)致一個(gè)細(xì)胞中同時(shí)存在兩種類型mtDNA，即形成異質(zhì)性細(xì)胞，這種類型的細(xì)胞在連續(xù)分裂過(guò)程中會(huì)改變突變型和野生型的比例。因此，在對(duì)群體進(jìn)行嚴(yán)謹(jǐn)?shù)姆肿舆z傳結(jié)構(gòu)特征分析時(shí)，有必要考慮核DNA 與mtDNA的遺傳差異，選擇合適的mtDNA 區(qū)域進(jìn)行遺傳變異分析。有大量采用Cytb 序列、D-loop 序列或其他mtDNA基因區(qū)域進(jìn)行分析的研究報(bào)道[5,15-16]。mtDNA 不同區(qū)域的進(jìn)化速率不同，采用mtDNA 不同區(qū)域分析得到的群體遺傳結(jié)構(gòu)特征必然有所差異，對(duì)于mtDNA 不同區(qū)域遺傳得到的群體遺傳結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行比較和量化分析有助于進(jìn)一步深入理解群體之間的遺傳結(jié)構(gòu)特征差異。

當(dāng)前大多數(shù)采用Cytb 或（和）D-loop 分子標(biāo)記的研究停留于分析不同種類生物群體的遺傳結(jié)構(gòu)特征，未對(duì)Cytb 和D-loop 研究結(jié)果進(jìn)一步對(duì)比分析，在一定程度上限制了研究結(jié)果的參考和應(yīng)用價(jià)值。該研究基于Cytb方法所得到的群體間遺傳距離均小于基于D-loop 標(biāo)記所得到的相應(yīng)遺傳距離，表明D-loop 區(qū)域序列堿基變異速率大于Cytb 區(qū)域，D-loop 標(biāo)記相對(duì)于Cytb 標(biāo)記具有更高的區(qū)分能力，這一結(jié)論與其他類似研究結(jié)論相一致[17-19]。該研究Cytb 方法所得到的群體間遺傳距離僅為基于D-loop 標(biāo)記所得到相應(yīng)遺傳距離的0.795 15，D-loop 標(biāo)記所得群體間遺傳距離是Cytb 方法所得相應(yīng)遺傳距離的約1.25 倍。群體遺傳分化指數(shù)是群體遺傳結(jié)構(gòu)的另一項(xiàng)重要考量指標(biāo)[6]。根據(jù)楊慧榮等[20]研究赤眼鱒的資料，采用Cytb 與D-loop 方法的群體間Fst 比值與本研究呈現(xiàn)相似的規(guī)律，基于Cytb 的遺傳分化指數(shù)在程度上大于D-loop 的遺傳分化指數(shù)，剔除其Fst 偏離較大及出現(xiàn)負(fù)值的情況，可比的Cytb/D-loop 比率范圍在1.172 03～1.283 45 之間。該研究根據(jù)2種方法得到的群體間遺傳分化指數(shù)比率范圍1.051 40～2.914 65，平均值1.506 55，即基于Cytb 的遺傳分化指數(shù)約為D-loop 方法所得遺傳分化指數(shù)的1.5 倍。本研究遺傳距離比率和遺傳分化指數(shù)比率結(jié)果可為其他采用單種Cytb 或D-loop標(biāo)記方法研究對(duì)像遺傳結(jié)構(gòu)特征提供參考。這同時(shí)也表明，采用DNA 不同區(qū)域、不同分子標(biāo)記方法聯(lián)合分析結(jié)果將更為客觀。

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