王 帥，伊 雪，鄔鵬宇，崔翔宇，楊學慧，王耕野，鄭素琴，楊 方，李占清

0 引 言

心肌細胞凋亡在心肌缺血再灌注損傷(ischemia/reperfusion injury，IRI)占有重要地位［1］。萊菔硫烷(Sulforaphane，SFN)能通過抑制心肌細胞凋亡，減輕離體心臟的心肌IRI［2］，然而對心臟移植的IRI是否有保護作用尚未見報道。本實驗通過建立大鼠腹腔同種異體異位心臟移植模型，觀察SFN是否通過調控細胞凋亡來減輕心臟移植的IRI。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雄性Lewis大鼠60只，BN大鼠20只，3月齡，體重200～220g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，合格證號:SCXX(京)2011-0007，清潔級(SPF)，飼養(yǎng)于河北聯合大學動物實驗中心，自由進食飲水，室溫控制在(25±2)℃，單籠飼養(yǎng)，自然光照。SFN購自美國Sigma公司，HTK液(德國克勒化學制藥生產)由德國海德堡大學提供，抗Caspase-3抗體購自英國Abcam公司，Tunel試劑盒購自德國Calbiochem公司。

1.2 實驗分組及模型建立 Lewis大鼠40只，配對比較法隨機分為2組，每組20只。對照組:受體大鼠于移植前24 h經尾靜脈注射等滲鹽水0.5 mL;實驗組:受體大鼠于移植前24 h經尾靜脈注射SFN 2.5 mg/kg。實驗組和對照組的供心均冷藏于4℃ HTK液18h，建立大鼠心臟移植模型［3］。具體操作如下:經大鼠腹腔注射苯巴比妥鈉(20 mg/kg)、肌內注射氯胺酮(100mg/kg)麻醉后，摘取供體大鼠心臟，將供心升主動脈、肺動脈與受體大鼠腹主動脈、下腔靜脈端側吻合;吻合完畢后放開阻斷夾見冠狀動脈充血，5～10s心臟復跳，檢查吻合口無出血，關腹。

1.3 移植心臟存活時間 20只BN大鼠作為供體，20只Lewis大鼠作為受體，每組各10只。對照組及實驗組的處理同上述。建立心臟移植模型后，每天早晚2次觸摸受體腹部，了解移植心臟跳動情況，直至其停止跳動，記錄移植心臟存活天數，使用Kaplan-Meier分析其生存率。

1.4 觀察指標 ①生存率:采用Kaplan-Meier方法進行生存率分析;②移植心臟功能:采用半定量方法評價移植心臟的功能［4］，即心臟吻合完畢后放開阻斷夾，然后通過直接觸診、肉眼及顯微鏡觀察移植物來評價移植心臟的功能，共分為4分。1分:能通過顯微鏡可見肌束顫動和肌纖維顫動，但觸摸不到;2分:能觸摸到弱的或局部的心肌收縮;3分:兩心室同源性收縮，但心跳的頻率和強度降低;4分:收縮的強度和頻率正常。③心肌細胞凋亡指數:移植后24h摘取移植心臟，留取心肌組織標本，應用Tunel法檢測心肌細胞凋亡。④心肌組織中Caspase-3蛋白的表達:移植后24h摘取移植心臟，留取心肌組織標本，應用免疫組織化學檢測心肌組織Caspase-3蛋白表達，并按照半定量分析方法進行免疫組化評分［5］。

1.5 統計學分析 采用SPSS 17.0統計軟件進行分析。計量資料數據以均數±標準差()表示，組間比較采用t檢驗，采用Kaplan-Meier方法進行生存率分析，組間比較用 Logranke檢驗。以 P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 生存率 采用Kaplan-Meier方法進行生存率分析，實驗組移植心臟的中位生存期與對照組比較明顯提高(7 d vs 5 d，P ＜0.05)，見圖1。

圖1 2組大鼠移植心臟存活時間比較Figure 1 Comparison of the survival time of the transplanted heart in rats

2.2 移植心臟功能評分 移植后實驗組移植心臟的功能評分較對照組明顯提高［(3.67±0.21)分 vs(2.44±0.29)分］，差異有統計學意義(P ＜0.05)。見表1。

2.3 心肌組織中Caspase-3蛋白的表達 對照組大量的心肌細胞細胞質呈陽性染色，且染色較深;實驗組細胞質呈陽性染色較淺，見圖2。與對照組相比，實驗組大鼠心臟組織中Caspase-3蛋白免疫組化評分明顯下降［(1.38 ±0.14)分 vs(2.03 ±0.21)分，P=0.039］，見表1。

圖2 移植24h后2組大鼠心肌組織中Caspase-3蛋白的表達(IHC ×200)Figrue 2 Expression of Caspase-3 in myocardium tissues at 24h after heart transplantation in rats(IHC×200)

2.4 心肌細胞凋亡指數 對照組大量的心肌細胞核染成褐色或棕褐色，可見大量的凋亡細胞;實驗組凋亡細胞明顯減少。見圖3。移植24 h后，實驗組供心心肌細胞凋亡指數較對照組顯著降低(0.56±0.04 vs 0.78 ±0.01，P ＜0.05)，見表1。

圖3 移植24h后2組大鼠心肌細胞凋亡比較(TUNEL ×400)Figure 3 Myocardial apoptosis at 24 h after heart transplantation in rats(TUNEL×400)

表1 大鼠移植心臟功能評分、Caspase-3蛋白的表達及心肌細胞凋亡指數比較()Table 1 Comparison of cardiac function scores，the expression of Caspase-3 and the apoptosis index of myocardial cells at 24 h after heart transplantation in rats()

表1 大鼠移植心臟功能評分、Caspase-3蛋白的表達及心肌細胞凋亡指數比較()Table 1 Comparison of cardiac function scores，the expression of Caspase-3 and the apoptosis index of myocardial cells at 24 h after heart transplantation in rats()

與對照組相比，*P＜0.05，＊＊P ＜0.01

指 標 對照組(n=20) 實驗組(n=20)移植心臟功能評分(分) 2.44 ±0.29 3.67 ±0.21*Caspas-3 蛋白表達(分) 2.03 ±0.21 1.38 ±0.14*心肌細胞凋亡指數 0.78 ±0.01 0.56 ±0.04＊＊

3 討 論

心肌缺血和再灌注損傷中存在2種不同的細胞死亡方式，即凋亡和壞死。心肌缺血損傷中以壞死為主，而IRI中以凋亡為主。研究表明，細胞凋亡在心肌IRI中占有重要地位［1］。Caspsase-3是調亡蛋白酶級聯反應的必經之路［6］，被認為是導致細胞凋亡的關鍵酶，被稱作死亡蛋白酶，它的激活標志著細胞凋亡的開始［7］。

近年來研究表明，SFN能直接作用于Keap1，使Keap1與 Nrf2分開，后者與 ARE結合從而激活Nrf2-ARE信號通路，誘導內源性II相酶(phase II enzyme)的表達，清除缺血再灌注或外來物產生的活性氧自由基［4，8］，減輕 IRI［9］。Angeloni等［10］給予幼鼠的心室肌細胞不同時間(30 min～48 h)SFN(5 μmol/L)的預處理，發(fā)現SFN能明顯提高Ⅱ期酶的活性、蛋白及基因的表達，說明SFN通過誘導二期酶的產生，發(fā)揮抗氧化作用，增強細胞對氧化應激的防御能力，發(fā)揮其保護心肌的作用。Piao等［11］在大鼠的離體心臟的IRI同樣發(fā)現SFN通過抗氧化作用減輕心肌的組織損傷。而SFN是否通過抗凋亡作用減輕IRI未見報道。

本實驗的結果顯示:與對照組相比，SFN預處理能明顯抑制 Caspase-3 蛋白的表達(2.03 ±0.21 vs 1.38 ±0.14，P ＜0.05);同樣 Tunel結果顯示:與對照組相比，經SFN預處理組移植心臟的細胞凋亡指數明顯降低(0.78 ±0.01 vs 0.56 ±0.04，P ＜0.05)。我們考慮 SFN在心肌的冷IRI中同樣起作用，SFN預處理能明顯降低由于IRI引起的Caspase-3水平的升高，從減輕心肌細胞的凋亡，減輕心肌的組織損傷。與Piao等［11］的研究結果相一致。同樣我們研究發(fā)現SFN能提高移植心臟的中位生存期(7d vs 5d，P＜0.05)和改善移植心臟功能(3.67 ±0.21 vs 2.44 ±0.29，P ＜0.05)，SFN 能夠減輕心臟移植中IRI，提高移植心臟的存活時間和功能。這與 So?owiej等［12］研究相一致。

總之，SFN能減輕移植心臟心肌IRI，其保護作用可能與其抑制Caspase-3蛋白的表達，同時減少心肌細胞凋亡有關，但其具體機制尚需進一步探討。

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