杜驍杰，郭靜靜，王 晶，李 敏，王 玲，王長軍，潘秀珍

0 引 言

蛋白質磷酸化是信號轉導系統(tǒng)的核心，其中激酶和磷酸酶的協(xié)同作用介導著蛋白質可逆的磷酸化，精確地調(diào)控細胞的各項生命活動，包括細胞的生長、分裂、分化以及代謝等［1］。絲氨酸/蘇氨酸激酶(serine/threonine kinase，STK)和 STP是蛋白質可逆性磷酸化的重要酶類，長期以來認為其只存在于真核生物中，近年來的研究表明，在原核生物中也存在真核樣 STK 和磷酸酶［1－2］。

豬鏈球菌是一種重要的人獸共患病病原菌，目前對其信號轉導系統(tǒng)的研究主要集中在二元信號轉導系統(tǒng)中［3－8］。我們的前期研究已分離出2型豬鏈球菌中國強毒株05ZYH33，對其進行了全基因組測序分析［9］，發(fā)現(xiàn)和真核生物同源的stk/stp。本研究對stp進行原核表達及純化，對純化的重組蛋白進行酶活性測定，為進一步闡明STK/STP磷酸化系統(tǒng)的調(diào)控機制打下基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質粒和引物 2005年S.suis 2 05ZYH33分離自四川資陽中毒性休克綜合征患者。E.coli BL21、E.coli DH5α、pET28a 均由本實驗室保存。pMD18-T購自Takara公司。對stp基因設計上下游引物，引物由上海賽百盛基因技術有限公司合成，堿基序列如下堿基序列如下:STP-L:CATATGATGGCTTTTTCATCGGTCA(下劃線為引入的Nde I酶切位點)，STP-R:CTCGAGTTACCTAGCCTCCTCCGT(下劃線為引入的XhoⅠ酶切位點)

1.1.2 試劑 Taq polymerase、dNTP、T4 DNA 連接酶、限制性內(nèi)切酶BamH Ⅰ、XhoⅠ、DNA Marker和質粒提取試劑盒購自TaKaRa公司，蛋白Marker購自Fermentas公司，PCR割膠回收試劑盒購自promega公司，蛋白表達誘導劑IPTG購自南京生興生物公司。THB培養(yǎng)基購自美國Difco公司。HRP標記的羊抗鼠IgG、鄰苯二胺(DAB)顯色液購于武漢博士德生物工程有限公司;His-Tag單克隆抗體購自上海艾比瑪特生物醫(yī)學有限公司。pNPP stock購于ScienCell(美國)公司。Tris購于南京百斯凱公司。MnCl2、MgCl2和CaCl2購于廣東汕頭西隴化工股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 stp的生物信息學分析 根據(jù)S.suis中國強致病株05ZYH33的全基因組序列和注釋結果，利用BLAST程序，對CDSSSU0427進行在線比對，并對蛋白進行保守功能域檢索。MEGA 5.0軟件繪制stp的進化樹。

1.2.2 pET28a::stp的構建 用引物對 STP-L/STPR擴增05ZYH33 stp目的片段，將stp PCR產(chǎn)物連入pMD18-T并轉化E.coli DH5α感受態(tài)，構建成功后測序比對，命名為 pMD18-T-stp。pMD18-T-stp和pET28a用NdeⅠ/XhoⅠ進行雙酶切，酶切產(chǎn)物進行回收，回收產(chǎn)物經(jīng)T4 DNA Ligase連接后轉化E.coli BL21，對轉化子進行PCR和酶切鑒定，成功后命名為pET28a::stp。

1.2.3 pET28a::stp的表達及純化 將 pET28a::stp/BL21于5mL含Kana的LB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，1∶100加入新鮮培養(yǎng)基后，37℃振蕩培養(yǎng)至A600值約0.6，加IPTG至終濃度為1 mmol/L，16℃誘導培養(yǎng)。離心收集菌體并用超聲波破碎細胞，離心后收集上清，利用Ni2+親和層析柱純化目的蛋白。12%SDSPAGE電泳檢測目的蛋白的相對分子質量。

1.2.4 Western blot鑒定 取純化的STP重組蛋白進行SDS-PAGE電泳，采用電轉印法將蛋白轉移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h;加His-Tag單克隆抗體(1∶4000)，4℃過夜;用HRP標記的羊抗鼠IgG(1∶4000)孵育1 h;加DAB顯色液顯色。

1.2.5 酶活鑒定 參照文獻［10］，重組蛋白的磷酸酶活性檢測以pNPP為底物，通過測定A450值的變化間接檢測酶的活性。將2 μg重組蛋白STP與5 μL pNpp stock混合后加入事先配置的反應緩沖液［含 1 μmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，2 mmol/L MnCl2、MgCl2或 CaCl2］，常溫孵育，每隔1 min 檢測 A405值。

2 結 果

2.1 05ZYH33 stp基因的生物信息學分析 通過Blastp比對發(fā)現(xiàn)STP蛋白的氨基酸序列與GenBank上的肺炎鏈球菌PhpP、變形鏈球菌pppL、無乳鏈球菌SaSTP和化膿鏈球菌SP-STP的氨基酸序列一致性分別為69%、59%、59%和60%。保守功能結構域檢索發(fā)現(xiàn)STP屬于金屬依賴型磷酸酶家族PP2C亞家族，其在進化上也較為保守。見圖1。

圖1 S.suis 2 05ZYH33 STP的生物信息學分析Figure 1 Bioinformation of STP

2.2 重組表達載體pET28a::stp的構建和鑒定以05ZYH33基因組DNA為模板，STP-L/STP-R擴增stp全長基因，擴增產(chǎn)物大小約為810 bp，與理論值一致。將PCR擴增產(chǎn)物割膠回收進行純化，與pMD18-T載體相連后測序，測序結果經(jīng)比對正確，將stp連入pET28a后構建重組表達載體pET28a::stp，雙酶切結果證實了pET28a::stp的成功構建。

圖2 重組質粒的PCR及酶切鑒定Figure 2 Identification of the recombinant plasmid by PCR and restriction enzymes

2.3 pET28a::stp的表達及重組蛋白的純化pET28a::stp/BL21經(jīng)IPTG誘導后，16℃下誘導培養(yǎng)，超聲波破碎細胞后離心收集上清及沉淀，SDS-PAGE分析表明，16℃下STP可正常表達，且主要存在于上清中。利用Ni2+親和層析柱對表達產(chǎn)物進行純化，250 mmol/L洗脫目的蛋白，透析去除咪唑，得到重組蛋白STP。見圖3。

圖3 pET28a::stp的誘導表達及STP純化檢測Figure 3 Expression of STP and the detection of purified STP protein

2.4 STP的 Western blot分析 Western blot結果顯示，STP可以和His-Tag單抗發(fā)生反應，在蛋白相對分子質量大小約32 000處有明顯的特異蛋白條帶，說明該重組蛋白的確是stp的表達產(chǎn)物。見圖4。

圖4 用His-Tag單抗對重組表達蛋白進行免疫印跡檢測Figure 4 Western blot of the recombinant STP

2.5 重組蛋白磷酸酶活性的鑒定 用含有3種不同離子(Mn2+、Mg2+或Ca2+)的緩沖液孵育蛋白與作用底物的混合物，通過檢測A405值的變化，間接檢測磷酸酶的活性。我們發(fā)現(xiàn)，只有Mn2+存在下，STP才具有磷酸酶活性，提示該蛋白具有金屬離子依賴性。見圖5。

圖5 STP磷酸酶活性的間接檢測Figure 5 Phosphatase assays of STP

3 討 論

STP通過催化底物蛋白絲氨酸或蘇氨酸磷酸化羥基的去磷酸化，完成對信號的傳遞。根據(jù)分子結構、對金屬離子的依賴性以及對抑制劑的敏感性的不同，STP被分為兩大家族，即磷蛋白磷酸酶(phosphoprotein phosphatase，PPP)和金屬依賴型磷酸酶(metal-dependent phosphatase，PPM)［11］。本研究在2型豬鏈球菌中發(fā)現(xiàn)STP編碼基因stp，生物信息學分析顯示STP蛋白屬于PPM家族PP2C亞家族，該亞家族成員結構類似人蛋白質磷酸酶2C［11］。其與常見致病菌株肺炎鏈球菌、無乳鏈球菌、化膿鏈球菌、變形鏈球菌STP蛋白具有很高的同源性，在進化上具有保守性。

在枯草芽孢桿菌中，stk/stp激活細菌孢子萌發(fā)的轉錄因子［12］。在金黃色葡萄球菌中，stk/stp調(diào)節(jié)細菌細胞壁的結構和對抗生素的敏感性［13］。無乳鏈球菌中，stk/stp影響著細菌的毒力和形態(tài)結構［14－15］。目前對stk/stp系統(tǒng)的研究主要集中在stk中，單獨對stp的報道并不多見，且在某些菌株中stp是必須基因，對該基因不能進行突變研究［16］。本課題組前期發(fā)現(xiàn) S.suis 2中國強毒株 05ZYH33 STK/STP編碼基因，對激酶 stk進行敲除株的構建［17］。本研究針對stk相鄰的磷酸酶stp開展相關研究，以05ZYH33基因組為模板擴增出stp基因，將其連入表達載體pET28a并轉入宿主菌后進行原核表達，親和層析獲得了純度較高的STP蛋白。

PPM家族蛋白的酶活性需要有金屬離子(Mg2+或Mn2+)的參與［11］，本實驗間接地測定出重組STP蛋白的磷酸酶活性，且只有在Mn2+存在的條件下才具有該活性，在Mg2+或Ca2+存在下則沒有活性。本研究結果為進一步闡明STK/STP系統(tǒng)在豬鏈球菌磷酸化信號轉導系統(tǒng)中的作用打下基礎。

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