曹志星+呂威+趙曄+等

【摘要】 目的：檢測宮頸活檢組織中上皮內(nèi)瘤變（CIN）及其旁組織中hTERC基因的表達(dá)情況，對(duì)比分析其陽性率的變化，試圖找到基因水平上CIN手術(shù)治療范圍。方法：采用熒光原位雜交技術(shù)（FISH）檢測63例宮頸活檢標(biāo)本中hTERC基因的表達(dá)變化情況。結(jié)果：宮頸高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變（HSIL）區(qū)、瘤變邊緣≤1 mm、1 mm<瘤變邊緣≤2 mm、2 mm<瘤變邊緣≤3 mm以及3 mm<瘤變邊緣≤4 mm的hTERC基因陽性率分別為100%、92.31%、87.18%、64.10%和30.77%，其中，HSIL與瘤變邊緣2 mm以內(nèi)范圍各點(diǎn)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；HSIL與瘤變邊緣2 mm以外范圍各點(diǎn)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；宮頸低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變（LSIL）區(qū)、瘤變邊緣≤1 mm范圍、1 mm<瘤變邊緣≤2 mm、2 mm<瘤變邊緣≤3 mm以及3 mm<瘤變邊緣≤4 mm的hTERC基因陽性率分別為41.67%、25.00%、4.17%、4.17%和4.17%，其中，LSIL與瘤變邊緣1 mm以內(nèi)范圍各點(diǎn)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），而LSIL與瘤變邊緣1 mm以外范圍點(diǎn)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：活檢標(biāo)本中，隨著距瘤變區(qū)范圍的增加，hTERC基因的陽性率明顯下降，其中，距瘤變邊緣>2 mm和>1 mm或許可以分別作為HSIL和LSIL基因水平上（更精確意義上的）CIN的手術(shù)治療范圍。

【關(guān)鍵詞】 熒光原位雜交； 宮頸上皮內(nèi)瘤變； hTERC基因； 宮頸活檢組織； 手術(shù)治療范圍

在世界范圍內(nèi)，女性宮頸癌發(fā)病率居女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤第2位[1]。近年來，其發(fā)病呈年輕化趨勢，但因?qū)m頸癌有較長的癌前病變期，早期診斷及合理治療便成為改善預(yù)后的關(guān)鍵[2]。目前研究得知，宮頸細(xì)胞由非典型性異常病變細(xì)胞轉(zhuǎn)化成癌細(xì)胞的過程中幾乎都伴有3號(hào)染色體長臂的擴(kuò)增，其中涉及到的最重要的基因可能是人染色體末端酶基因（human telomerase gene，hTERC），它有望成為非典型細(xì)胞癌變的基因[3]。Heselmeyer-haddad等[4]研究認(rèn)為hTERC基因可以作為預(yù)測高度病變（HSIL）的指標(biāo)，隨訪這些病例1～3年后，hTERC基因擴(kuò)增病例中CINⅠ/Ⅱ進(jìn)展到CINⅢ多于hTERC基因不擴(kuò)增病例，表明特異的基因組改變是CIN發(fā)展到宮頸癌所必需的[5]。同時(shí)，多項(xiàng)研究表明，采用FISH技術(shù)檢測宮頸細(xì)胞hTERC基因的陽性率，可作為宮頸上皮內(nèi)瘤變由低級(jí)別進(jìn)展到高級(jí)別的指標(biāo)，還可以提高宮頸癌前病變的篩查幾率，是一種損傷較小的、比較可靠的檢測手段[6-10]。有研究報(bào)道不同制片方法中，hTERC基因雜交成功率石蠟包埋組織切片為85.7%，其熒光信號(hào)滿意率也最高，且在指導(dǎo)宮頸病變及宮頸癌的治療中，石蠟包埋組織切片法的染色體破壞最小，實(shí)際意義更大。因而，不同于以往的使用脫落細(xì)胞進(jìn)行的研究，本實(shí)驗(yàn)全部采用組織活檢標(biāo)本。同時(shí)，除檢測CIN處的hTERC基因陽性率外，還對(duì)病變旁組織做不同范圍的hTERC基因表達(dá)研究，試圖找到規(guī)律性變化，探討基因水平上CIN的手術(shù)治療范圍?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 選取2013年10月-2014年7月本院宮頸組織活檢標(biāo)本63例，每例均完整包含連續(xù)的瘤變組織及其旁組織（距瘤變邊緣≥4 mm）。其中，低級(jí)別病變24例，高級(jí)別病變39例，年齡22～62歲，取標(biāo)本前所有患者均未進(jìn)行放療、化療及其他特殊治療。另外選取20例正常宮頸組織活檢標(biāo)本建立閾值。

1.2 FISH探針 北京金菩嘉醫(yī)療科技有限公司生產(chǎn)的TERC/CSP3 DNA雙色探針。TERC基因標(biāo)記在3q26.3位點(diǎn)，CSP3 DNA標(biāo)記在3號(hào)染色體著絲粒處（3q11.1-q11.1），分別用紅色和綠色熒光信號(hào)標(biāo)記，以CSP3探針作為對(duì)照。

1.3 方法

1.3.1 樣本制備 將普通載玻片清洗干凈后，涂多聚賴氨酸以防脫片，自然晾干備用。將預(yù)先篩選出的石蠟包埋組織做2 μm連續(xù)切片，展開后撈片，置70 ℃烤箱中2 h。

1.3.2 樣本預(yù)處理 將玻片置于二甲苯中脫蠟，兩缸，各10 min，依次經(jīng)100%乙醇、85%乙醇、75%乙醇至去離子水，各1缸，各2 min，然后置于火力60的微波爐內(nèi)水煮20 min，在2×SSC溶液中浸泡5 min后晾干，加胃蛋白酶20 μL（20 mg/mL），消化5 min左右，室溫下2×SSC溶液中漂洗2次，5 min/次。最后將玻片依次置于75%乙醇、85%乙醇、100%乙醇各2 min脫水，烤片至56 ℃，干燥備用。

1.3.3 雜交 避光環(huán)境中，將探針混合液10 μL（2 μL探針，8 μL雜交緩沖液）滴于玻片雜交區(qū)域，加上蓋玻片，封膠；83 ℃水浴中變性5 min，將玻片置于預(yù)熱的濕盒中，42 ℃恒溫培養(yǎng)箱中過夜雜交。

1.3.4 洗片 第2天在暗處移去蓋玻片，依次經(jīng)46 ℃預(yù)熱的2×SSC溶液和NP40溶液（40 mL 2×SSC溶液，40μL NP40洗滌液）洗滌，各1缸，分別為10 min和5 min，70%乙醇浸泡3 min，自然干燥，滴加15 μL DAPI（聯(lián)咪二苯吲哚）復(fù)染劑，加蓋玻片，分析。

1.4 FISH信號(hào)分析 復(fù)染后的玻片用OLYMPUS B×51熒光顯微鏡在DAPI/FIFC/RHOD三色濾光鏡激發(fā)下，觀察間期細(xì)胞的熒光雜交信號(hào)。

1.5 閾值建立 20例正常宮頸組織活檢標(biāo)本，在100×10油鏡下觀察，每例隨機(jī)計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞。單個(gè)間期細(xì)胞核中紅綠信號(hào)比2：2為正常細(xì)胞；紅色信號(hào)>2個(gè)，綠色信號(hào)≥2個(gè)判斷為陽性細(xì)胞。計(jì)算每例出現(xiàn)陽性細(xì)胞的百分比，建立閾值，閾值=平均數(shù)（x）+3×標(biāo)準(zhǔn)差（SD）。本例閾值為8.66%，取整數(shù)9。

1.6 結(jié)果判定 100×10倍油鏡下觀察，每例隨機(jī)計(jì)數(shù)100個(gè)間期細(xì)胞，單個(gè)間期細(xì)胞核中紅綠信號(hào)比2∶2為正常細(xì)胞；紅色信號(hào)>2個(gè)，綠色信號(hào)≥2個(gè)判斷為陽性細(xì)胞。記錄紅綠信號(hào)數(shù)hTERC：CSP3，陽性細(xì)胞個(gè)數(shù)≥閾值（本實(shí)驗(yàn)為9個(gè)）為hTERC基因擴(kuò)增陽性。endprint

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計(jì)數(shù)資料比較采用 字2檢驗(yàn)，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.2 宮頸活檢高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變（HSIL）區(qū)及其旁組織中hTERC基因的擴(kuò)增情況 宮頸高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變（HSIL）區(qū)、瘤變邊緣≤1 mm、1 mm<瘤變邊緣≤2 mm、2 mm<瘤變邊緣≤3 mm以及3 mm<瘤變邊緣≤4 mm的hTERC基因陽性率分別為100%、92.31%、87.18%、64.10%和30.77%，其中，HSIL與瘤變邊緣≤1 mm、1 mm<瘤變邊緣≤2 mm比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（字2=5.10，P>0.05；字2=3.20，P>0.05）；HSIL與2 mm<瘤變邊緣≤3 mm、HSIL與3 mm<瘤變邊緣≤4 mm、1 mm<瘤變邊緣≤2 mm范圍與2 mm<瘤變邊緣≤3 mm、2 mm<瘤變邊緣≤3 mm與3 mm<瘤變邊緣≤4 mm范圍的比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（字2=17.06，P<0.05； 字2=41.29，P<0.05； 字2=5.64，P<0.05； 字2=8.69，P<0.05）。

2.3 宮頸活檢低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變（LSIL）區(qū)及其旁組織中hTERC基因的擴(kuò)增情況 宮頸低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變（LSIL）區(qū)、瘤變邊緣≤1 mm、1 mm<瘤變邊

緣≤2 mm、2 mm<瘤變邊緣≤3 mm以及3 mm<瘤變邊緣≤4 mm范圍的hTERC基因陽性率分別為41.67%、25.00%、4.17%、4.17%和4.17%，其中，LSIL與瘤變邊緣≤1 mm、1 mm<瘤變邊緣≤2 mm與2 mm<瘤變邊緣≤3 mm、2 mm<瘤變邊緣≤3 mm與3 mm<瘤變邊緣≤4 mm比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（字2=1.50，P>0.05； 字2=0，P>0.05； 字2=0，P>0.05），而LSIL與1 mm<瘤變邊緣≤2mm、LSIL與2 mm<瘤變邊緣≤3 mm、LSIL與3 mm<瘤變邊緣≤4 mm、瘤變邊緣≤1 mm與1 mm<瘤變邊緣≤2 mm的比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（字2=9.55，P<0.05； 字2=9.55，P<0.05； 字2=9.55，P<0.05； 字2=4.18，P<0.05）。

3 討論

宮頸癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多因素參與的、漫長而又復(fù)雜的過程，歷經(jīng)鱗狀上皮不典型增生、宮頸上皮內(nèi)瘤變（CIN）等癌前病變過程。因此，對(duì)CIN進(jìn)行有效的早期篩查、診治，是非常有必要的[12]。

目前宮頸癌的早期篩查主要依靠TCT和HPV檢測，但兩者的臨床應(yīng)用有一定局限性。細(xì)胞學(xué)檢查（TCT）是一種形態(tài)學(xué)檢查，受觀察者主觀因素的影響，有時(shí)難以做出正確診斷[13]；而針對(duì)HPV DNA的實(shí)驗(yàn)也只能測出當(dāng)時(shí)HPV的狀態(tài)，大多數(shù)婦女特別是性生活活躍的年輕女性，HPV感染是暫時(shí)的，且HPV陽性不能反映細(xì)胞變異的狀態(tài)，使HPV陽性的預(yù)測意義較低，事實(shí)上ASCUS和輕度細(xì)胞學(xué)異常在年輕女性中很常見，但低度病變發(fā)展到宮頸癌的比率并不高。因此需要尋找其他檢測指標(biāo)以彌補(bǔ)這些檢測方法的不足。

近幾年，大量針對(duì)宮頸癌的研究表明，宮頸細(xì)胞癌變的過程中幾乎都伴有3號(hào)染色體3q26～3q27區(qū)域的擴(kuò)增，而hTERC基因定位于該區(qū)域，提示，hTERC基因是與宮頸癌相關(guān)的一個(gè)重要基因[14]。熒光原位雜交（FISH）技術(shù)是一項(xiàng)分子細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)，采用標(biāo)記單鏈核苷酸為探針，按照堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，與待測未知單鏈核苷酸雜交，形成熒光顯微鏡下可見的熒光信號(hào)，近年來應(yīng)用日益廣泛[15-16]。FISH技術(shù)敏感性高、特異性好、定位準(zhǔn)確、結(jié)果直接清晰，是一項(xiàng)客觀有效的指標(biāo)，已被用于膀胱癌、乳腺浸潤癌等的基因檢測中。利用FISH技術(shù)來檢測宮頸脫落細(xì)胞和石蠟包埋組織細(xì)胞中hTERC基因的擴(kuò)增也已被證實(shí)可行，且其陽性率隨宮頸病變分級(jí)的上升而逐漸增高[17-21]。

本研究應(yīng)用FISH技術(shù)檢測宮頸活檢組織細(xì)胞中hTERC基因的表達(dá)情況，不僅檢測病變部位組織的hTERC基因表達(dá)情況，而且利用測微尺，連續(xù)觀測及檢測距病變部位不同距離的組織中hTERC基因表達(dá)情況，以期證實(shí)：（1）隨著距瘤變部位的距離增加，hTERC基因的擴(kuò)增是突然降低還是逐漸降低；（2）如果是隨著距瘤變區(qū)距離的增加，hTERC基因擴(kuò)增逐漸減少，那么距瘤變區(qū)多少的距離處，hTERC基因表達(dá)降至與正常鱗狀上皮一致。

本研究中，應(yīng)用FISH技術(shù)檢測宮頸活檢組織細(xì)胞中hTERC基因的表達(dá)情況，利用測微尺連續(xù)觀察宮頸活檢高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變（HSIL）區(qū)及其旁組織中hTERC基因的擴(kuò)增情況，發(fā)現(xiàn)：（1）隨著距瘤變部位距離的增加，hTERC基因的擴(kuò)增表達(dá)是逐漸下降的，即病變處hTERC基因的擴(kuò)增100%表達(dá)，距病變區(qū)越遠(yuǎn)該基因的擴(kuò)增率越小并逐漸達(dá)到正常，說明hTERC基因的擴(kuò)增率與距瘤變部位的距離有相關(guān)性；（2）HSIL在距瘤變邊緣約2 mm處以外hTERC基因的表達(dá)下降至接近正常鱗狀上皮水平，其各范圍陽性率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），表明2 mm以內(nèi)雖然HE染色鏡下觀察細(xì)胞已無明顯異型性，但是2 mm及以外是基因水平上較正常上皮，是否可以在HSIL術(shù)中將距病變2 mm作為安全的手術(shù)范圍仍是值得探討的問題；（3）對(duì)LSIL區(qū)及其旁組織中hTERC基因擴(kuò)增情況的觀察表明，病變旁1 mm處兩側(cè)的組織中hTERC基因表達(dá)率有差異，即距病變部位邊緣約1 mm處該基因的表達(dá)率可能降至正常鱗狀上皮表達(dá)水平，其各范圍陽性率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。雖然對(duì)LSIL患者不主張手術(shù)治療，但在臨床上常遇到患者h(yuǎn)TERC基因檢測表達(dá)率升高，患者因過分緊張、擔(dān)心而要求手術(shù)者，在這種情況下，將距病變1 mm作為安全的手術(shù)范圍也是值得探討的。

本實(shí)驗(yàn)希望能為今后CIN手術(shù)在保證治療安全的前提下最大可能減少創(chuàng)傷，起到拋磚引玉的作用，為宮頸癌前病變的篩查、早期診斷及治療提供新的途徑。endprint

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（收稿日期：2014-07-16） （本文編輯：蔡元元）endprint

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（收稿日期：2014-07-16） （本文編輯：蔡元元）endprint

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