王艷梅,李 非,蔡齊飛,代 莉,黃 帥,馬天曉，劉 震

(1.河南農(nóng)業(yè)大學林學院, 河南 鄭州 450002； 2.黃河科技學院, 河南 鄭州 450000)

不同分布區(qū)山桐子ISSR遺傳差異性分析

王艷梅1,李 非1,蔡齊飛1,代 莉1,黃 帥1,馬天曉2，劉 震1

(1.河南農(nóng)業(yè)大學林學院, 河南 鄭州 450002； 2.黃河科技學院, 河南 鄭州 450000)

以江西贛州、南昌、九江,貴州貴陽、遵義,湖南張家界,浙江臨安,湖北宜昌,四川成都、廣元、重慶,河南洛陽12個分布區(qū)的山桐子葉片為材料,對山桐子的遺傳差異進行分析.結(jié)果表明:(1)用選出的10個引物對12個分布區(qū)共110個DNA樣品進行PCR擴增,共擴增出92條重復性高、清晰的條帶,擴增片段相對分子質(zhì)量為200～2 500,平均每個引物擴增位點為9.2個,各引物擴增出的條帶數(shù)為6～11條,其中多態(tài)性位點85個,多態(tài)性比率為87.5%～100%,平均多態(tài)性比率為92.91%；(2)12個分布區(qū)山桐子的遺傳多樣性存在一定差異.其中Nei基因多樣性指數(shù)(H)和Shannon指數(shù)(I)所表現(xiàn)的山桐子12個分布區(qū)種群遺傳多樣性規(guī)律一致,其順序依次為：廣元>重慶>贛州>成都>張家界>宜昌>遵義>九江>洛陽>貴陽>臨安>南昌；(3)山桐子分布區(qū)間與分布區(qū)內(nèi)都產(chǎn)生了顯著的遺傳分化(P<0.001),且主要在分布區(qū)內(nèi),占變異成分的78.01%,基因流Nm為0.8521,Nm<1；(4)不同分布區(qū)之間的遺傳一致度為0.723 6～0.980 6,UPGMA聚類顯示,當相似系數(shù)為0.868時,可聚為3類,九江為1類,贛州為1類,其余10個分布區(qū)為1類,進行遺傳距離與地理距離相關(guān)性分析,顯著水平P>0.05.

山桐子；遺傳差異；ISSR

山桐子含油率高,其油既可以食用,也可以制造生物質(zhì)柴油,是重要的生物質(zhì)能源,被譽為“美麗的樹上油庫”,具有較高的綠化、美化、觀賞性及重要的經(jīng)濟價值,且具有廣闊的應用前景,開發(fā)應用潛力巨大.近年來,山桐子作為重要生物質(zhì)能源樹種越來越引起人們的重視.劉震等[1]研究了不同種源山桐子的休眠特性,把樹木冬休眠類型重新劃分為北方系冬休眠類型、南方系冬休眠類型以及紅潤類型；祝志勇等[2, 3]研究了山桐子種子發(fā)芽率及果實含油率和脂肪酸組分的變化.錢學射等[4,5]研究發(fā)現(xiàn)，取果浸于堿水法發(fā)芽率最高達到20%,也對毛葉山桐子種子、果實含油量及油脂成分進行了測定與分析.梁珍海等[6]研究了日本山桐子引種育苗及苗期生長規(guī)律.楊幼林等[7]研究了毛葉山桐子果實不同發(fā)育期的含油率；吳志文等[8]對山桐子的研究進展及應用前景進行了分析；歲立云等[9]對山桐子果實性狀的自然變異及類型劃分進行了研究.但山桐子多為野生,人為干擾嚴重,導致寶貴的野生資源正在流失.ISSR標記(inter-simple sequence repeat)是ZIETKEIWITCZ等[10]在SSR技術(shù)基礎(chǔ)上改進并提出了一種用來檢測簡單重復序列間的多態(tài)性分子標記技術(shù),即簡單重復序列間擴增(inter-simple sequence repeat).ISSR標記是一種多態(tài)性和信息量豐富的分子標記技術(shù),為顯性標記,呈孟德爾遺傳規(guī)律,而且PCR擴增的穩(wěn)定性及多態(tài)性都很好,是一種非常理想的分子標記.ISSR標記由于引物較長,退火溫度較高,增強了試驗的可靠性和可重復性,不需要預先知道被分析基因組DNA的序列信息,簡化了引物設(shè)計的過程,ISSR 可以提供更多的多態(tài)性信息.與RFLP,AFLP相比,ISSR 的DNA用量較少、安全性高、更快捷、更穩(wěn)定而且成本較低；與RAPD相比,ISSR更可靠,重復性好,能產(chǎn)生更高的多態(tài)性,同時更簡便易操作；與SSR相比,ISSR引物可在不同物種間通用；近年來,該技術(shù)已經(jīng)廣泛的應用到遺傳圖譜構(gòu)建、品種鑒定、基因定位、植物基因組作圖、遺傳多樣性分析等研究[11～14].本研究利用ISSR標記分析不同分布區(qū)山桐子的遺傳變異,對進一步開展山桐子種質(zhì)資源的收集、保存、分析評價及良種選育研究工作具有重要意義.

1 材料和方法

1.1試驗材料

本研究以贛州、貴陽、遵義、南昌、張家界、九江、臨安、宜昌、成都、廣元、重慶、洛陽12個分布區(qū)(表1)自然分布的山桐子幼嫩葉片為材料(由于在自然分布狀況下山桐子的繁殖率低,很少出現(xiàn)大片的山桐子林,所以采樣按盡可能多的數(shù)目來采集).用高壓滅菌的去離子水將樣品沖洗干凈后,電子天平秤其質(zhì)量,每1 g放入標記好的自封袋里,置于-80 ℃的冰箱里保存?zhèn)溆?

表1 不同分布區(qū)位置與氣候條件Table 1 The position and climate of different distribution

續(xù)表1 continuing table

注：VA2:甌江、閩江、南嶺區(qū); VA4:貴州區(qū); VA1:江南區(qū); IVA1:江北區(qū); VA3:四川區(qū); IVA2:秦巴區(qū); ⅢB2:魯淮區(qū).

Note: VA2:Oujiang、Minjiang、Nanling AREA; VA4:Guizhou AREA; VA1:Jiangnan AREA; IVA1:Jiangbei AREA; VA3:Sichuan AREA; IVA2:Qinba AREA;ⅢB2:Luhuai AREA.

1.2ISSR分析體系

1.2.1 DNA 提取與檢測 采用CTAB 法提取高質(zhì)量的山桐子基因組DNA[15].1%瓊脂糖凝膠電泳(北京六一儀器廠, DYCP-31DN) 檢測DNA 的完整性, 用紫外分光光度計( Eppendorf Biophotometer 6131) 測定DNA 的質(zhì)量濃度和純度.

1.2.2 引物合成及來源 ISSR引物主要由哥倫比亞大學(UBC)公布的引物以及黃文俊等[16,17]發(fā)表的引物進行篩選,共10條,由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成.

1.2.3 ISSR-PCR反應體系及程序 本試驗使用已經(jīng)優(yōu)化的ISSR-PCR反應體系,25 μL反應體系為：14.8 μL ddH2O, 2.5 μL Buffer, 1.5 μL Mg2+, 0.5 μL dNTP,0.5 μL引物 ,0.2 μL Tap酶, 5 μL DNA模板(以上藥品均來源于上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司).PCR擴增反應程序：94 ℃預變性3 min,94 ℃變性30 s,58 ℃ 退火45 s,72 ℃延伸45 s,44個循環(huán),72 ℃終延伸8 min,然后在4 ℃下保存.

1.2.4 擴增產(chǎn)物瓊脂糖電泳檢測 用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測,在凝膠成像系統(tǒng)觀察并記錄譜帶.

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 用WD-9413A凝膠成像系統(tǒng)進行拍照,并統(tǒng)計條帶,采用人工讀帶法,根據(jù)條帶的遷移率和有無記錄二元數(shù)據(jù),有帶記為1,無帶記為0,排除模糊不清的帶和無法準確標志的帶,而后排列成矩陣.利用NTSYS 2.10軟件進行數(shù)據(jù)分析,采用POPGENE 32計算種群遺傳多樣性和遺傳分化等指數(shù),采用AMOVA 1.55軟件進行種群遺傳變異分析.

2 結(jié)果與分析

2.1ISSR-PCR擴增結(jié)果

10條引物對12個分布區(qū)共110個DNA樣品進行PCR擴增,共擴增出92條重復性高、清晰的條帶,擴增片段相對分子質(zhì)量為150～2 500,平均每個引物擴增位點為9.2個,各引物擴增出的條帶數(shù)為6～11條,其中多態(tài)性位點85個,多態(tài)性比率為87.5%～100%,平均多態(tài)性比率為92.91%(表2).圖1-圖4為部分引物擴增的ISSR 標記瓊脂糖凝膠電泳圖.

表2 10個ISSR引物擴增條帶數(shù)與多態(tài)性比率Table 2 Amplified bands number and polymorphism rate of the 10 ISSR primers

圖1 引物829 1-31電泳通道的擴增結(jié)果Fig.1 The ISSR-PCR pattem using primer 829 1-31

圖2 引物829 32-62電泳通道的擴增結(jié)果Fig.2 The ISSR-PCR pattem using primer 829 32-62

圖3 引物829 63-93電泳通道的擴增結(jié)果Fig.3 The ISSR-PCR pattem using primer 829 63-93

圖4 引物829 94-124電泳通道的擴增結(jié)果

2.2不同分布區(qū)山桐子遺傳多樣性

用Popgene 32對12個分布區(qū)山桐子的遺傳多樣性進行分析(表3),結(jié)果表明,12個分布區(qū)山桐子種群間存在一定差異.其中Nei基因多樣性指數(shù)(H)和Shannon指數(shù)(I)所表現(xiàn)的山桐子12個分布區(qū)種群遺傳多樣性規(guī)律一致,其順序依次為：廣元>重慶>贛州>成都>張家界>宜昌>遵義>九江>洛陽>貴陽>臨安>南昌,與有效等位基因數(shù)Ne的結(jié)果略有不同,多態(tài)位點百分率(P)和等位基因數(shù)(Na)的評價結(jié)果為：廣元>重慶>張家界>成都>宜昌>贛州>遵義>洛陽>九江>臨安>貴陽>南昌.但總體來看,位于山桐子分布中心區(qū)的廣元、重慶、張家界、成都、宜昌有較高的遺傳多樣性,而位于分布區(qū)邊緣的贛州、遵義、洛陽、九江、貴陽、臨安南昌種群遺傳多樣性偏低.但沒有隨緯度的變化而呈現(xiàn)出有規(guī)律的變化.

表3 不同分布區(qū)山桐子遺傳多樣性Table 3 Genetic diversity in Idesia polycarpa from different provenances

2.3不同分布區(qū)山桐子種群遺傳分化

用Popgene 32計算出總遺傳多樣性Ht值為0.002 1～0.499 8,平均值為0.267 2,群體內(nèi)遺傳多樣性Hs值為0.000 0～0.371 1,平均值為0.168 4,群體間遺傳多樣性Dst(Dst=Ht-Hs)為0.098 8,基因分化系Gst的變動范圍較大,平均值為0.369 8,基因流Nm為0.852 1(表4),WRIGHT[18]認為：當Nm>1時,基因流可以防止由遺傳漂變而引起的群體間的遺傳分化,在本試驗中Nm<1,說明種群間基因流動很少.

用AMOVA軟件對不同分布區(qū)山桐子進行群體遺傳變異分析(表5),結(jié)果表明,山桐子分布區(qū)間與分布區(qū)內(nèi)都產(chǎn)生了顯著的遺傳分化(P<0.001),山桐子的遺傳多樣性主要在分布區(qū)內(nèi),占變異成分的78.01%,只有21.99%的變異存在于不同種群間.說明山桐子的變異主要存在分布區(qū)內(nèi),分布區(qū)間的遺傳分化較小.

表4 不同分布區(qū)山桐子遺傳分化及基因流Table 4 Genetic differentiation and gene flow of Idesia polycarpa from different provenances

表5 不同分布區(qū)山桐子AMOVA分析Table 5 AMOVA analysis of Idesia polycarpa from different provenances

2.4不同分布區(qū)山桐子遺傳距離與地理距離的相關(guān)性

遺傳距離和遺傳相似度是衡量種群間遺傳分化程度最重要的指標.由表6知,不同分布區(qū)之間的遺傳一致度為0.723 6～0.980 6,說明不同分布區(qū)山桐子群體間的相似程度較高.其中重慶和張家界2個分布區(qū)的遺傳距離最小,為0.019 6,其中南昌和九江2個分布區(qū)的遺傳距離最大,為0.323 5.山桐子分布區(qū)間的遺傳距離并沒隨緯度變化而呈現(xiàn)明顯的變化規(guī)律.將遺傳距離與地理距離做相關(guān)性分析,顯著水平P>0.05,說明山桐子不同分布區(qū)間遺傳距離與地理距離沒有相關(guān)性.

表6 不同分布區(qū)山桐子種群Nei遺傳距離和遺傳一致度Tab.6 Nei′s unbiased measures of genetic identity and genetic distance in Idesia polycarpa from different provenances

注：遺傳相似度在右上角,遺傳距離在左下角.

Note:Nei′sgenetic identity (above diagonal) and genetic distance (below diagonal).

2.5不同分布區(qū)山桐子聚類分析

利用NTSYS軟件計算不同分布區(qū)山桐子ISSR擴增結(jié)果的相似系數(shù),進行UPGMA聚類分析(圖5),為山桐子種質(zhì)資源的保護和品種選育等提供參考與依據(jù).結(jié)果表明,當相似系數(shù)為0.868時,可聚為3類,九江為1類,贛州為1類,其余10個分布區(qū)為1類.

圖5 不同分布區(qū)山桐子聚類分析 Fig.5 Cluster analysis in Idesia polycarpa from different provenances

3 結(jié)論與討論

10條引物對12個分布區(qū),共110個DNA樣品進行了PCR擴增,共擴增出92條重復性高、清晰的條帶,擴增片段相對分子量為150～2 500,平均每個引物擴增位點為9.2個,各引物擴增處的條帶數(shù)為6～11條,其中多態(tài)性位點85個,平均多態(tài)性比率為92.91 %,有研究發(fā)現(xiàn),雙子葉植物多態(tài)位點百分率 (P) 平均值為44．8%,長命多年生木本植物多態(tài)位點百分率 (P) 值為64.7%,相比而言,山桐子具有較高的遺傳多樣性水平. 龐廣昌等[19]認為，不同種群間遺傳變異大小,可以在某種程度上說明該物種對不同環(huán)境適應的廣泛程度,一般種群間變異越大,該物種適應環(huán)境的能力就越強.本研究采用AMOVA對山桐子遺傳變異的分布格局進行了分析,結(jié)果表明，山桐子在不同分布區(qū)間具有顯著的遺傳分化,說明山桐子具有較強的環(huán)境適應能力,同時有良好的產(chǎn)生新突變、適應新環(huán)境的基因基礎(chǔ)和進化遺傳潛力,對山桐子的長期生存與應用推廣是有利的.

對12個分布區(qū)山桐子的遺傳多樣性進行分析,結(jié)果表明,12個分布區(qū)的山桐子種群間存在一定差異.其中Nei基因多樣性指數(shù)(H)與Shannon指數(shù)(I)所表現(xiàn)的山桐子不同分布區(qū)遺傳多樣性規(guī)律一致,其順序依次為：廣元>重慶>贛州>成都> 張家界>宜昌>遵義>九江>洛陽>貴陽>臨安>南昌,與有效等位基因數(shù)(Ne)的結(jié)果略有不同,多態(tài)位點百分率(P)和等位基因數(shù)(Na)的評價結(jié)果為：廣元>重慶>張家界>成都>宜昌>贛州>遵義>洛陽>九江>臨安>貴陽>南昌.但總體來看,位于山桐子分布中心區(qū)的廣元、重慶、張家界、成都、宜昌有較高的遺傳多樣性,而位于分布區(qū)邊緣的贛州、遵義、洛陽、九江、貴陽、臨安南昌種群遺傳多樣性偏低.但是沒有隨著緯度的變化而呈現(xiàn)出有規(guī)律的變化.

用AMOVA軟件對不同分布區(qū)山桐子進行群體遺傳變異分析,結(jié)果表明,山桐子分布區(qū)間與分布區(qū)內(nèi)都產(chǎn)生了顯著的遺傳分化(P<0.001),山桐子的遺傳多樣性主要存在于種群內(nèi),種群內(nèi)的變異占變異成分的78.01%,只有21.99%的變異存在于不同種群之間.說明山桐子的變異主要存在分布區(qū)內(nèi),分布區(qū)間的遺傳分化較小.總遺傳多樣性Ht值為0.002 1～0.499 8,平均值為0.267 2,群體內(nèi)遺傳多樣性Hs值為0.000 0～0.371 1,平均值為0.168 4,群體間遺傳多樣性Dst(Dst=Ht-Hs)為0.098 8,基因分化系數(shù)Gst的變動范圍較大,平均值為0.369 8,基因流Nm為0.852 1,WRIGHT[18]認為：當Nm>1時,基因流可以防止由遺傳漂變而引起的群體間的遺傳分化,在本研究中Nm<1,說明種群間基因流動很少.

遺傳距離和遺傳相似度是衡量種群間遺傳分化程度最重要的指標.本研究結(jié)果表明,不同分布區(qū)之間的遺傳一致度為0.723 6～0.980 6,說明不同分布區(qū)山桐子群體間的相似程度較高.其中重慶和張家界兩個分布區(qū)的遺傳距離最小,為0.019 6,南昌和九江兩個分布區(qū)的遺傳距離最大,為0.323 5.山桐子分布區(qū)間的遺傳距離并沒隨緯度變化而呈現(xiàn)明顯的規(guī)律變化.將遺傳距離與地理距離做相關(guān)性分析,顯著水平P>0.05,說明山桐子不同分布區(qū)間遺傳距離與地理距離沒有相關(guān)性.這與李曉東等[20]對水杉、穆立薔等[21]對紫椴的研究結(jié)果顯示遺傳距離與地理距離間不存在顯著相關(guān)性的研究結(jié)果相一致；但也與有的學者研究結(jié)論不同,如李群等[22]對延齡草的遺傳距離和地理距離進行相關(guān)性分析,結(jié)果表明2者具有一定的相關(guān)性.同時也有一些學者研究認為2者相關(guān),李珊等[23]對金錢槭和云南金錢械居群的研究表明,認為2者在大尺度上遺傳距離與地理距離相關(guān)而在小范圍內(nèi)則沒有相關(guān)關(guān)系.

本研究結(jié)果表明山桐子保持著較高的遺傳多樣性水平,遺傳變異豐富.近年來,山桐子作為生物質(zhì)能源的重要材料,對其人為干擾,使生境遭到破壞,導致寶貴野生資源正在流失.LANDE[24]認為物種瀕危的機制主要是棲息地的破壞、環(huán)境污染、生境退化和生物資源過度利用,而遺傳多樣性喪失,更可能是受到干擾的癥狀而非原因.同時,生長立地條件的破壞和生境退化等造成種群隔離和個體數(shù)量減少,從長遠來看會減少物種遺傳多樣性,而種群遺傳多樣性減少易使種群趨于滅亡[25].因此,對山桐子的保護主要是進行就地保護,保護其現(xiàn)有棲息地,減少人為干擾對其生境的破壞,更好地保護群體的遺傳特異性.

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(責任編輯：梁保松)

TheISSRinheritancedifferenceanalysisofIdesiaPolycarpaindifferentdistributionareas

WANG Yan-mei1, LI Fei1, CAI Qi-fei1, DAI Li1, HUANG Shuai1, MA Tian-xiao2, LIU Zhen1
(1.College of Forestry, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China； 2.Huanghe Science and Technology College, Zhengzhou 450000, China)

The preliminary inheritance difference analysis was conducted with theIdesiapolycarpaleaves from 12 different distribution areas like Ganzhou, Nanchang, Jiujiang, Guiyang, Zunyi, Zhangjiajie, Lin’an, Yichang, Chengdu, Guangyuan, Luoyang. The main research results are as follows : (1)PCR amplification was conducted with 110 DNA samples from 12 distribution and 10 selected primers. We obtain 92 high repeatable and clear band whose length was between 200 and 2 500. Each primer amplification locus is 9.2 averagely. Each primer gets 6～11 band. There are 85 polymorphic site. The polymorphic percentage was 87.5%～100%.The average polymorphic percentage was 92.91%. (2)Certain difference existed in the genetic diversity of 12 distribution areas. The genetic diversity rule expressed byNeigenetic diversity index(H) and Shannon index(I) was accordant. And the sequence was Guangyuan>Chongqing>Ganzhou>Chengdu>Zhangjiajie>Yichang>Zunyi>Jiujiang>Luoyang>Guiyang>Lin’an>Nanchang ； (3)The prominent genetic differentiation (P<0.001) was produced in distribution interval and distribution areas, but mainly in distribution areas (78.01% of the total.) .The gene flowNmwas 0.8521<1;(4)The genetic consistency was 0.723 6～0.980 6. By UPGMA clustering when the similarity coefficient was 0.868 we could classify the 12 distribution areas into three classes: Jiujiang, one class, Ganzhou, another class, and the remaining 10 the third class. The correlation analysis between the genetic distance and the geographical distance was conducted, with significance level atP>0.05.

Idesiapolycarpa; genetic difference; ISSR

1000-2340(2014)06-0706-07

S792

：A

2014-06-12

林業(yè)行業(yè)專項項目(201204806)

王艷梅,1978年生，女，河南信陽人，副教授，博士，從事樹木生理生態(tài)方面的研究.

劉 震,1964年生，男，河南沈丘人，教授，博士.