胡志蘋，黃志華，黃 誠

（贛南醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，江西贛州341000）

α7尼古丁受體（Alpha 7nicotinic receptor，α7nAChR）在抗炎免疫反應(yīng)中扮演著重要的角色。有實驗表明，乙酰膽堿（acetyl choline，ACh）可抑制體外培養(yǎng)的脂多糖刺激引起的巨噬細(xì)胞釋放 TNF、IL－6、IL－1β及IL－18，刺激迷走神經(jīng)可抑制大鼠肝臟TNF的合成，降低炎癥免疫反應(yīng)［1］，進(jìn)一步的實驗發(fā)現(xiàn)乙酰膽堿是通過與巨噬細(xì)胞膜上α7nAChR結(jié)合而發(fā)揮抑制炎性細(xì)胞因子的合成及分泌的作用［2］。小鼠外周血與脾組織的淋巴細(xì)胞可表達(dá)mAChRs和nAChRs［3］，本實驗也發(fā)現(xiàn)小鼠免疫細(xì)胞上有α7nAChR的表達(dá)［4］。以上實驗結(jié)果提示，α7nAChR可能參與了電針（electroacupuncture，EA）調(diào)節(jié)免疫功能的作用，但其作用機(jī)制不清楚。為此，本研究應(yīng)用α7nAChR抗體和特異性的α7nAChR拮抗劑α－銀環(huán)蛇毒（αbungarotoxin，α－Bgt），進(jìn)一步證實α7nAChR在電針對 NK細(xì)胞活性中的作用，旨在為EA的臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)和參考。

1 材料與方法

1.1 材料 雄性昆明小鼠，體質(zhì)量18～22g，由江西中醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供，自然照明，自由飲水、飲食。實驗嚴(yán)格按照贛南醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)倫理委員會的相關(guān)規(guī)定。α－Bgt（T0195）購自Sigma公司；α7nAChR抗體（SC－5544）購自Santa Cruz生物科技有限公司。對小鼠進(jìn)行分組，每組9只。（1）為檢測α7nAChR抗體的作用，實驗分6組：對照組、IgG組、α7nAChR抗體組、100Hz EA組、100Hz EA＋I(xiàn)gG和100Hz EA＋α7nAChR抗體組；（2）為檢測特異性的α7nAChR拮抗劑α－Bgt的作用，實驗分9組：對照組、1.5μg／mL a－Bgt組、3.0μg／mL a－Bgt組、扎針組（needle組）、扎針 ＋1.5μg／mL a－Bgt組、扎針＋3.0μg／mL a－Bgt組、100Hz EA組、100Hz EA＋1.5 μg／mL a－Bgt組和100Hz EA＋3.0μg／mL a－Bgt組。

1.2 方法

1.2.1 EA刺激 分別給予小鼠雙后肢的足三里和三陰交插針，并與HANSEA刺激儀相連，對照組于穴位附近扎針后不通電流，處理時間與100Hz EA組相同，刺激強(qiáng)度以0.5、1.0、1.5mA方式遞增各刺激10min，共30min，每天1次，連續(xù)刺激3d。

1.2.2 脾臟NK細(xì)胞殺傷活性檢測 靶細(xì)胞的制備：細(xì)胞培養(yǎng)24h后，1 000r／min，離心時間5min，棄上清液，加入2mL RPMI－1640培養(yǎng)液重懸，用苔盼藍(lán)染色檢測細(xì)胞活性應(yīng)大于90%；細(xì)胞濃度調(diào)至5×105mL－1。效應(yīng)細(xì)胞的制備：無菌取脾，用100目不銹鋼篩機(jī)械分離，Hank′s液洗2次，以10%胎牛血清RPMI－1640培養(yǎng)液重懸，用苔盼藍(lán)染色檢測細(xì)胞活性應(yīng)大于90%，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107mL－1。效－靶細(xì)胞作用：96孔培養(yǎng)板中各加入100μL YAC－1細(xì)胞及效應(yīng)細(xì)胞，效－靶比為20∶1，另設(shè)效應(yīng)細(xì)胞孔及靶細(xì)胞孔，均為3復(fù)孔，將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO2溫箱中培養(yǎng)20h，每孔加10μL MTT（5 mg／mL），37℃、5%CO2環(huán)境中培養(yǎng)4h。結(jié)果觀察：取出培養(yǎng)板，2 000r／min，離心5min，棄上清液，加二甲基亞砜150 μL，震蕩5min，酶標(biāo)儀570nm讀取光密度（OD）值，計算NK細(xì)胞的殺傷活性＝［1－（實驗孔OD值－效應(yīng)細(xì)胞OD值）／靶細(xì)胞對照孔OD值］×100%。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用Prism5.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，計量資料以表示。數(shù)據(jù)分析采用單因素方差分析并繼之以Newman－Keuls檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 α7nAChR抗體對100Hz EA作用脾臟NK細(xì)胞活性的影響 在EA前，預(yù)先給予小鼠抗α7nAChR抗體后，觀察100 Hz EA對小鼠NK細(xì)胞活性的影響。結(jié)果顯示，分別與100 Hz EA組和100Hz EA＋I(xiàn)gG組相比，100Hz EA＋α7nAChR抗體組的NK細(xì)胞活性均明顯增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖1。

圖1 α7nAChR抗體對100Hz EA作用脾臟NK細(xì)胞活性的影響

圖2 α7nAChR特異性拮抗劑α－Bgt對100Hz EA作用脾臟NK細(xì)胞活性的影響

2.2 特異性的α7nAChR拮抗劑α－Bgt對100Hz EA作用脾臟NK細(xì)胞活性的影響 在EA前，分別給予小鼠不同劑量的特異性α7nAChR拮抗劑α－Bgt后，觀察100Hz EA對小鼠NK細(xì)胞活性的影響。結(jié)果顯示，與100Hz EA組相比，100Hz EA＋1.5μgα－Bgt組和100Hz EA ＋3.0μgα－Bgt組均明顯增強(qiáng)了NK細(xì)胞活性，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），見圖2。

3 討 論

ACh作為神經(jīng)遞質(zhì)在中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮信息傳遞的作用。近年來的研究顯示，膽堿能系統(tǒng)在機(jī)體免疫調(diào)節(jié)中起重要作用。小鼠淋巴細(xì)胞表達(dá) ACh、ChAT、mAChRs和nAChRs［3］，淋巴細(xì)胞合成和釋放的ACh可通過作用于免疫細(xì)胞上的mAChRs和nAChRs來發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用［5］，mAChRs和nAChRs參與了對細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)作用（如IL－6）［6］，這些證據(jù)均支持膽堿能系統(tǒng)參與了免疫功能調(diào)節(jié)過程。

在小鼠上存在16種不同的nAChRs亞單位（α1－7、α9－10、β1－4、δ、ε、γ），他們組成了多種具有不同結(jié)構(gòu)和藥理性質(zhì)的同構(gòu)五聚體和異構(gòu)五聚體［7］。在淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞上主要表達(dá)nAChRs中 的 α2，α5－7，α10 和 β2 亞 單 位［8］。 在 這 些nAChRs的 亞 單 位 中，對 α7nAChR 的 研 究 較 多［9－10］。α7nAChR對免疫細(xì)胞起負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用，這種作用主要是通過抑制TNF－α、IFN－γ和IL－6等細(xì)胞因子的合成和釋放來實現(xiàn)的，而且發(fā)現(xiàn)在α7nAChR基因敲除小鼠血清中的致炎性細(xì)胞因子含量明顯升高［11－12］。因此，目前認(rèn)為7nAChR是膽堿能系統(tǒng)調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的關(guān)鍵受體，它的興奮介導(dǎo)了大部分的ACh在免疫系統(tǒng)中的效應(yīng)［13］。

有研究表明，EA可提高刺激副交感神經(jīng)的作用效果［14］。課題組前期研究結(jié)果提示，α7nAChR可能參與了100Hz EA對小鼠NK細(xì)胞活性的調(diào)節(jié)作用。因此，本實驗選擇α7nAChR作為研究EA通過膽堿能系統(tǒng)調(diào)節(jié)免疫功能的切入點。結(jié)果顯示，連續(xù)3d給予100Hz EA刺激后，小鼠NK細(xì)胞活性明顯降低。如預(yù)先給予抗α7nAChR的抗體后，再進(jìn)行100Hz EA刺激，小鼠的NK細(xì)胞活性顯著升高；同樣，進(jìn)一步應(yīng)用特異性的α7nAChR拮抗劑α－Bgt的實驗也觀察到100Hz EA可顯著地升高NK細(xì)胞活性［15］。以上結(jié)果提示，小鼠免疫細(xì)胞上的α7nAChR在100Hz EA調(diào)節(jié)NK細(xì)胞活性中發(fā)揮重要作用。

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