張 朋，錫林寶勒日，白靖平，江仁兵，陳勇忠，黃 哲，李 星

（1.南京軍區(qū)福州總院四七六醫(yī)院骨科，福州350000；2.新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院骨與軟組織腫瘤科，烏魯木齊830011；3.凡星博奧北京科技有限公司，北京100080）

術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是乳腺癌患者死亡的主要原因，其中骨轉(zhuǎn)移的發(fā)生率為65%～75%，首發(fā)癥狀為骨轉(zhuǎn)移的患者占27%～50%［1－2］。乳癌患者一旦發(fā)生骨轉(zhuǎn)移，5年生存率僅為20%，并且還可引起一系列的并發(fā)癥，比如骨痛、骨損傷以及骨相關(guān)事件（SEEs）［1］，是目前臨床上降低乳腺癌患者生活質(zhì)量和影響患者生存的重要因素。本研究采用Clinprot液體芯片飛行時(shí)間質(zhì)譜系統(tǒng)（ClinprotTMMALDI－TOF MS）分析并篩選乳腺癌術(shù)后骨轉(zhuǎn)移與無(wú)轉(zhuǎn)移患者的血清差異蛋白，為尋找乳腺癌骨轉(zhuǎn)移相關(guān)的血清標(biāo)志物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，同時(shí)為進(jìn)一步闡明乳癌骨轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制以及開發(fā)逆轉(zhuǎn)骨轉(zhuǎn)移的靶向藥物提供理論研究基礎(chǔ)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2009年2月至2010年10月在新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院住院復(fù)查的女性乳腺癌改良根治術(shù)后患者36例，術(shù)后病理組織學(xué)診斷均為乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌。分組：（1）乳腺癌改良根治術(shù)術(shù)后單純骨轉(zhuǎn)移（M組）共18例。其中原發(fā)乳癌分期Ⅱ期6例，Ⅲ期12例。年齡37～77歲，平均（52.72±11.89）歲；術(shù)后至骨轉(zhuǎn)移時(shí)間為9～122個(gè)月，平均33.7個(gè)月；所有患者均已行足療程化療，其中5例ER（＋）、PR（＋），9例ER／PR（＋）均行內(nèi)分泌治療。入組者均經(jīng)ECT及局部CT、MRI 3項(xiàng)檢查診斷，其中4例因椎體破壞疼痛劇烈行經(jīng)皮穿刺椎體成形術(shù)，術(shù)后病灶組織病理結(jié)果支持診斷；且經(jīng)B超等相關(guān)檢查未發(fā)現(xiàn)重要臟器轉(zhuǎn)移。抽血時(shí)間為診斷次日晨。（2）乳腺癌改良根治術(shù)術(shù)后無(wú)轉(zhuǎn)移組（S組），共18例。組織學(xué)病理分期及術(shù)后時(shí)間均與M組相匹配的患者，年齡34～74歲，平均（52.89±12.37）歲；所有患者均已行足療程化療，其中6例ER（＋）、PR（＋），9例ER／PR（＋）均行內(nèi)分泌治療。入組者均經(jīng)骨放射性核素掃描（ECT）檢查未見明顯異常；B超等相關(guān)檢查未發(fā)現(xiàn)重要臟器轉(zhuǎn)移。兩組患者年齡等一般資料差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性，本研究經(jīng)患者知情同意和并經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)通過。

1.2 主要試劑與儀器 丙酮、乙腈、乙醇、醋酸銨（NH4Ac）、Peptide Calibration Standard、Protein Calibration StandardⅠ、弱陽(yáng)離子交換磁珠（MB－WCX）、三氟乙酸（TFA）、Tris－HCL等均購(gòu)自Sigma公司；MALDI－TOF－MS質(zhì)譜儀及配套的Clin－ProTools分析軟件購(gòu)自Bruker Daltonik公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本采集及處理 空腹抽取36例患者全血3mL，室溫下靜置1h，3 000r／min離心5min，取上清液加入對(duì)應(yīng)標(biāo)號(hào)的冷凍管中，每20μL一管分裝，－80℃保存。

1.3.3 試驗(yàn)方法

1.3.3.1 弱陽(yáng)離子磁珠（MB－WCX）的處理 （1）取10μL磁珠和10μL磁珠結(jié)合緩沖液（BB），混勻；（2）加入5μL血清，吹打混均；（3）置于磁珠分離器，靜置1min，移去上清液；（4）加入100μL磁珠清洗緩沖液（WB），靜置1min，移去上清液；（5）重復(fù)步驟（4）2次；（6）加入5μL磁珠洗脫緩沖液（EB），混勻；靜置2min，將洗脫液移入樣品管；（7）向洗脫液中加入5μL磁珠穩(wěn)定緩沖液（SB）混勻，－20℃保存至質(zhì)譜分析。

1.3.3.2 標(biāo)準(zhǔn)血清質(zhì)控 標(biāo)準(zhǔn)血清經(jīng)磁珠處理得到洗脫液，用質(zhì)譜采集數(shù)據(jù)，每批數(shù)據(jù)采集完畢，與數(shù)據(jù)庫(kù)已有對(duì)應(yīng)的相同磁珠相同采集方法的標(biāo)準(zhǔn)血清數(shù)據(jù)比較，變異系數(shù)（CV）＜30%。

1.3.3.3 樣品點(diǎn)靶 取5μL的0.4mg／mL HCCA基質(zhì)，加入1μL的樣品洗脫液，吹打混勻；取1μL上述混合液體，點(diǎn)在600μm Anchorchip上，室溫干燥。

1.3.3.4 樣品譜圖的生成 采用Clinprot液體芯片飛行時(shí)間質(zhì)譜系統(tǒng)獲取兩組患者血清肽質(zhì)量指定圖譜（PMF）。（1）在Clinprot Standard校正方法下，對(duì)累加標(biāo)準(zhǔn)品圖譜進(jìn)行校正，平均分子質(zhì)量偏差應(yīng)小于100ppm。（2）將樣品靶板放入Microflex質(zhì)譜儀，設(shè)定采集范圍：（1～20）×103Da，激光能量：采用高激光能量轟一下結(jié)晶點(diǎn)8shots，再用低于高激光能量10%～20%的能量采集50shots；（3）同一樣品同一結(jié)晶點(diǎn)，調(diào)整采集點(diǎn)，累加8個(gè)點(diǎn)的數(shù)據(jù)（400shots）。保存累加的PMF。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用ClinProTools軟件分析前先對(duì)樣品原始質(zhì)譜圖進(jìn)行處理，然后選擇軟件內(nèi)嵌的統(tǒng)計(jì)算法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，獲得兩組血清的差異表達(dá)蛋白，計(jì)量資料以x±s表示，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 質(zhì)譜檢測(cè)的重復(fù)性驗(yàn)證 試驗(yàn)前將所有標(biāo)本分成2份，5 d后重復(fù)檢測(cè)，試劑材料、方法步驟同前。結(jié)果顯示兩次PMF基本一致，隨機(jī)選擇4個(gè)蛋白峰計(jì)算CV均小于30%，該系統(tǒng)具有良好的可重復(fù)性，見圖1、2。

2.2 蛋白質(zhì)譜分析 采用Biomarker Wizard軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，未檢測(cè)到有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的蛋白質(zhì)峰譜差異，未能建立診斷模型，見表1。

續(xù)表1 蛋白質(zhì)譜統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

圖1 M組2次重復(fù)試驗(yàn)的PMF

圖2 S組2次重復(fù)試驗(yàn)的PMF

2.3 對(duì)差異最顯著的M8063.25Da和M9772.81Da進(jìn)行分析

在M組各個(gè)樣品譜圖中M8063.25Da和M9772.81Da的豐度大部分低于S組。平均圖譜中M組的M8063.25Da和M9772.81Da蛋白峰明顯低于S組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖3～5。

圖3 兩組樣本中M8063.25Da和M9772.81Da的質(zhì)譜堆積圖

表1 蛋白質(zhì)譜統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

圖4 兩組樣本中M8063.25Da和M9772.81Da的平均質(zhì)譜圖

圖5 兩組樣本中M8063.25Da和M9772.81Da的平均值標(biāo)準(zhǔn)差比較圖

3 討 論

ClinprotTM液體芯片飛行時(shí)間質(zhì)譜系統(tǒng)由功能磁珠、基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI－TOF－MS）、ANCHORCHIP技術(shù)和ClinProTools的生物信息學(xué)方法組成，已廣泛應(yīng)用于腫瘤標(biāo)志物的篩選、鑒定和疾病診斷模型的建立，如口腔癌［3］、卵巢癌［4］、腎細(xì)胞癌［5］、肺癌［6］、食管癌［7］、胃癌［8］、胰腺癌［9］、頭頸部惡性腫瘤［10］等疾病，并獲得了令人滿意的效果。

本研究采用Clinprot系統(tǒng)獲得乳腺癌術(shù)后骨轉(zhuǎn)移與無(wú)轉(zhuǎn)移患者血清PMF，發(fā)現(xiàn)兩組血清蛋白的表達(dá)在一定程度上存在差異，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

本研究沒有檢測(cè)到兩組間的差異蛋白，未能建立乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的診斷模型。分析其原因可能為：（1）骨髓微轉(zhuǎn)移（BMM）的影響。BMM理論：乳腺癌是一種全身性疾病，腫瘤細(xì)胞在早期就經(jīng)血流播散出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，即便原發(fā)腫瘤被切除，隱匿在體內(nèi)的微小轉(zhuǎn)移癌灶仍繼續(xù)發(fā)展。患者常無(wú)任何臨床表現(xiàn)，常規(guī)影像學(xué)檢查及常規(guī)病理檢查均難以發(fā)現(xiàn)。Slade等［11］對(duì)23例原發(fā)性乳腺癌外周血及骨髓進(jìn)行微轉(zhuǎn)移檢測(cè)，外周血陽(yáng)性率為13%，骨髓檢出率為61%。提示在乳腺癌BMM的診斷中，外周血的檢出率明顯低于骨髓檢出率，外周血檢測(cè)不能替代骨髓檢測(cè)。之后，Slade等［12］報(bào)道應(yīng)用定量PCR及免疫組織化學(xué)檢查外周血細(xì)胞角蛋白19（CK－19）發(fā)現(xiàn)，手術(shù)前51%患者存在BMM。收集的91例標(biāo)本中，采用定量PCR、免疫組織化學(xué)分別發(fā)現(xiàn)87%和65%的患者在隨訪期間出現(xiàn)BMM現(xiàn)象。因本研究患者均由CT、MRI或ECT等常規(guī)檢查確定診斷，不排除BMM對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響。（2）全身化療的影響。化療可減少或消滅微轉(zhuǎn)移灶，抑制微轉(zhuǎn)移灶的擴(kuò)展，減少生長(zhǎng)刺激因子的釋放，減少甚至殺滅腫瘤細(xì)胞。國(guó)內(nèi)外均有試驗(yàn)證實(shí)乳腺癌患者化療后外周血微轉(zhuǎn)移因子水平明顯下降。Manhani等［13］利用 RT－PCR檢測(cè)乳腺癌患者 CK－19，陽(yáng)性率由化療前的43.0%降至14.3%（3周期化療）和18.9%（6周期化療）。Zheng等［14］采用巢式RT－PCR方法檢測(cè)乳腺癌患者外周血中泌乳素誘導(dǎo)蛋白（PIP）mRNA的表達(dá)變化發(fā)現(xiàn)，PIP表達(dá)陽(yáng)性的患者中有76.5%化療后轉(zhuǎn)為陰性。Zhang等［15］經(jīng)半定量 RT－PCR檢測(cè)乳腺癌患者 CK－20mRNA，化療后31.8%轉(zhuǎn)為陰性，47.7%表達(dá)明顯下降。本研究中兩組患者均已接受化療，均可能對(duì)試驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生一定影響。（3）內(nèi)分泌治療的影響。乳腺癌的發(fā)生與雌激素的水平有關(guān)，內(nèi)分泌治療可改變激素依賴性腫瘤生長(zhǎng)所需的內(nèi)分泌微環(huán)境，使腫瘤細(xì)胞增殖停滯于G0或G1期，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖。兩組中均有部分患者接受內(nèi)分泌治療，不排除治療對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響。（4）由于研究經(jīng)費(fèi)及時(shí)間限制，有限的血清樣品只重復(fù)檢測(cè)了2次。

綜上所述，乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌改良根治術(shù)后單純骨轉(zhuǎn)移與無(wú)轉(zhuǎn)移患者不存在血清差異蛋白，不能通過檢測(cè)外周血的方法篩選乳腺癌骨轉(zhuǎn)移差異蛋白。通過上述研究，為筆者下一步加入骨髓進(jìn)行對(duì)照檢測(cè)，增加樣本量及重復(fù)檢測(cè)次數(shù)奠定了基礎(chǔ)。筆者希望能夠篩選出敏感性高、特異性強(qiáng)的腫瘤標(biāo)志物，最終能廣泛應(yīng)用于乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的篩查。

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