武成聰，李 強，陳佳濱，茹 嘉，蔡偉良，寧寅寬

（桂林醫(yī)學院附屬醫(yī)院骨科二病區(qū)，廣西桂林541000）

骨髓間充質(zhì)干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）是組織工程中重要的種子細胞之一，大量具有良好分化能力的干細胞經(jīng)多次傳代后老化、分化能力下降或者死亡［1］。將良好分化能力BMSCs凍存則可在需要時及時復(fù)蘇應(yīng)用。而凍存復(fù)蘇過程是否會對BMSCs生物特性、骨化潛能造成影響。本實驗旨在探討短期凍存兔BMSCs對其生物特征及其成骨分化能力的影響，為后期組織工程骨構(gòu)建奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 清潔級新西蘭白兔3只，1月齡，體質(zhì)量約0.5 kg，購于桂林醫(yī)學院動物實驗中心，實驗過程符合動物倫理學要求［2］。

1.2 主要試劑 低糖DMEM、胰蛋白酶、胎牛血清購于美國Hyclone公司；MTT、維生素C、β－磷酸甘油、地塞米松購于韓國BIOSHARP公司；小鼠抗兔CD44／CD45單克隆抗體、小鼠抗兔IgG1、PerCP生物素標記山羊抗小鼠IgG（H＋L）分別購于美國 ANTIGENIX、eBioscience、Jackson ImmunoResearch公司；小鼠抗兔CollagenⅠ購于武漢博士德生物工程有限公司；山羊抗小鼠IgG／辣根酶標記、DAB顯色試劑盒購于北京中杉金橋公司；茜素紅購于國藥集團化學試劑有限公司；堿性磷酸酶（ALP）測試盒購于南京建成生物工程研究所。

1.3 方法

1.3.1 細胞分離、凍存 無菌條件下穿刺股骨大轉(zhuǎn)子抽取骨髓、分離，界面層細胞以含15%胎牛血清的完全培養(yǎng)基，37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)。48h后首次換液，細胞鋪滿瓶底80%左右傳代。第5代加入凍存保護液，程序降溫后液氮保存。30d后復(fù)蘇培養(yǎng)，凍存后第10代BMSCs作為實驗組；凍存期間再次分離原代細胞第10代BMSCs作為對照組。

1.3.2 MTT比色法測定吸光度（OD） 實驗組、對照組各以2.5×103個／孔BMSCs接種96孔板，每組8個復(fù)制孔，按MTT檢測流程操作，波長490nm下測定OD值，連續(xù)檢測7 d，每天OD均值代表細胞增殖情況。

1.3.3 細胞周期檢測 隨機收集實驗組、對照組各3皿細胞固定，流式細胞儀進行細胞周期檢測。重復(fù)3次，得出細胞各周期的百分率并計算增殖指數(shù)（PI）＝（S＋G2M）／（G0／1＋S＋G2M）。

1.3.4 BMSCs表型檢測 選取實驗組、對照組每組各3皿細胞，設(shè)空白管、同型對照管、實驗管，按操作說明分別標記CD44／45－PerCP，流式細胞儀檢測。重復(fù)3次，各組陽性率做統(tǒng)計分析。

1.3.5 成骨分化檢測 實驗組和對照組各以105個／孔接種6孔板（免疫組織化學、茜素紅組作爬片處理）。細胞鋪滿瓶底80%后更換成骨誘導(dǎo)液（含10nmol／L地塞米松，15mmol／L維生素C，10mmol／Lβ－磷酸甘油）作不傳代培養(yǎng)誘導(dǎo)7、14d，各組取3孔，按ALP試劑盒說明操作，計算ALP水平。第14天，每組3張細胞爬片，Ⅰ型膠原免疫組織化學染色（SP法）。Image－Pro Plus（IPP）圖像軟件取3個區(qū)域測量（100倍，九點法），平均光密度代表單位面積Ⅰ型膠原水平。第21天茜素紅染色，IPP以紅色結(jié)節(jié)為標志分析鈣結(jié)節(jié)面積（總像素數(shù)）。均重復(fù)3次。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS11.0統(tǒng)計軟件進行分析，對各組數(shù)據(jù)作兩獨立樣本t檢驗，計量資料以表示，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 BMSCs培養(yǎng)情況 原代分離48h后首次換液，鏡下貼壁細胞即為BMSCs，數(shù)量較少，呈短梭狀，散在集簇狀分布，隨培養(yǎng)時間延長及傳代后細胞形成大量的小集落，呈長梭狀，匯合成片，旋渦狀排列（圖1A）；實驗組細胞復(fù)蘇后24h內(nèi)細胞可貼壁，不貼壁細胞數(shù)目較對照組增加，細胞梭形，較瘦長，部分細胞出現(xiàn)老化，總體而言細胞生長情況影響不大（圖1B）。

圖1 凍存前后兔BMSCs生長情況（×40）

2.2 MTT檢測OD值 實驗組細胞生長潛伏期延長，MTT檢測OD值從第3天開始增加（即細胞增殖速度），第4天后增殖速度能夠與對照組持平，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，n＝8），隨后進入平臺期，見表1。

2.3 BMSCs表面標志 實驗組、對照組表面抗原陽性率分別為 CD44：93.62% ±1.05%、93.95% ±0.71%；CD45：0.24%±0.11%、0.29%±0.10%，二者差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），凍存復(fù)蘇對BMSCs表面抗原無明顯影響，細胞并未因凍存而發(fā)生變異，見圖2。

表1 MTT檢測OD值±s）

表1 MTT檢測OD值±s）

組別0±0.13 0.47±0.06 0.53±0.07對照組 0.03±0.00 0.06±0.00 0.18±0.04 0.38±0.03 0.48±0.07 0.53±0.08 0.54±0.07 P 1d 2d 3d 4d 5d 6d 7d實驗組 0.03±0.00 0.03±0.00 0.08±0.01 0.29±0.05 0.4 0.21 0.00 0.00 0.00 0.14 0.17 0.81

圖2 第10代BMSCs表面標志表達情況

2.4 BMSCs周期檢測 實驗組與對照組G1、S、G2／M期的細胞比例及PI比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表2。

表2 第10代BMSCs各期細胞比例±s，%）

表2 第10代BMSCs各期細胞比例±s，%）

組別 G1 S G2 57.00±3.47 33.70±3.17 9.29±0.52 42.9±3.4對照組 56.84±2.27 34.20±0.94 8.93±2.41 43.0±2.3 P PI實驗組0.933 0.756 0.768 0.960

2.5 ALP表達情況 實驗組和對照組經(jīng)成骨誘導(dǎo)后7、14d，隨誘導(dǎo)時間增加ALP水平呈遞增趨勢，兩個時間點實驗組和對照組ALP水平變化差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表3。>

2.6 Ⅰ型膠原SP法檢測 成骨誘導(dǎo)14d，實驗組和對照組Ⅰ型膠原染色均呈陽性表達，細胞胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒，大小形態(tài)均一（圖3）。經(jīng)凍存后BMSCsⅠ型膠原蛋白表達量（平均光密度分析）變化與未凍存組相比，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表4。

表3 成骨誘導(dǎo)后第7、14天ALP水平±s，U／gprot）

表3 成骨誘導(dǎo)后第7、14天ALP水平±s，U／gprot）

組別6.73±1.92 15.99±4.36對照組 6.76±0.91 16.41±2.22 P 7d 14d實驗組0.97 0.79

2.7 鈣結(jié)節(jié)茜素紅染色 實驗組和對照組成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)到約10d細胞呈梭形表面粗糙，細胞間隙緊密，細碎顆粒、扁平樣改變，14d左右漩渦中心形成細胞團，21d形成鈣化結(jié)節(jié)，肉眼可見培養(yǎng)皿底散在白色狀物，染色后均為紅色（圖4），兩組鈣結(jié)節(jié)面積差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表4。

圖3 成骨誘導(dǎo)后14dⅠ型膠原染色（SP×100）

表4 Ⅰ型膠原、鈣結(jié)節(jié)染色情況±s）

表4 Ⅰ型膠原、鈣結(jié)節(jié)染色情況±s）

組別 平均光密度 鈣結(jié)節(jié)面積（像素）0.442±0.022 1 055 811.0±199 798.5對照組 0.456±0.015 1 155 874.0±222 157.3 P實驗組0.16 0.32

圖4 導(dǎo)后21d鈣結(jié)節(jié)茜素紅染色（×100）

3 討 論

BMSCs在特定的條件下能向骨、軟骨、脂肪、肌等細胞分化［3］。本研究采用密度梯度離心法［4］成功分離兔BMSCs，其生長狀態(tài)良好，能夠滿足后期骨組織工程種子細胞的要求。而BMSCs體外實驗中，其隨傳代增加會使細胞老化、分化能力逐漸下降或者死亡［5］。低溫凍存BMSCs則是存貯種子細胞的有效途徑，理論上在－196℃及凍存保護液作用下細胞生化反應(yīng)與活力代謝基本靜止，可無限期凍存細胞［6］。但實際效果不佳，凍存時細胞所處環(huán)境對細胞影響較大，其機制可能為溶質(zhì)反應(yīng)導(dǎo)致［7］。本實驗中，短期凍存BMSCs后，雖然生長增殖速度較對照組緩慢，但細胞狀態(tài)并未發(fā)現(xiàn)明顯變化，其增殖能力能與對照組相當。細胞周期中實驗組和對照組的絕大部分BMSCs處于G1期，具有較強的增殖分化能力，凍存后仍具有典型的干細胞增殖特點。

骨髓由多組細胞系組成，對于實驗分離得到及后續(xù)凍存復(fù)蘇后的BMSCs，是否是種子細胞或者其生物特征是否因細胞凍存過程而改變［8］。本研究通過標記細胞陽性表達的CD44和陰性表達的CD45檢測發(fā)現(xiàn)，通過密度梯度離心法獲得的靶細胞為BMSCs，實驗組對照組CD44陽性率均超過90%，不表達的CD45，經(jīng)統(tǒng)計分析說明了經(jīng)過短期凍存后的BMSCs并沒有發(fā)生分化或變異。

BMSCs成骨、成軟骨、成脂分化這一生物特性可以用來鑒定其多向分化潛能［9－10］。BMSCs的成骨分化必須在特定條件下進行，特定的化學物質(zhì)（β－磷酸甘油、地塞米松、維生素C等）可促使BMSCs向成骨細胞分化并能通過骨化標志性產(chǎn)物ALP、Ⅰ型膠原、礦化結(jié)節(jié)等驗證［11］。ALP高表達是成骨過程中成熟成骨細胞特異性標志之一［12］；Ⅰ型膠原蛋白分泌量增加標志著BMSCs向成骨細胞系分化［13］；細胞外基質(zhì)鈣化與Ca2＋沉積是成骨分化的終末期表現(xiàn)［14］。本研究發(fā)現(xiàn)，實驗組和對照組的BMSCs，其ALP表達量均隨誘導(dǎo)時間的增加而相應(yīng)增加；在相同時間點，實驗組、對照組Ⅰ型膠原蛋白均呈陽性表達，對比光密度發(fā)現(xiàn)其表達量并未因凍存細胞而改變。同樣，鈣結(jié)節(jié)染色也印證了低溫冷凍過程并未使BMSCs成骨分化能力發(fā)生質(zhì)的改變。

綜上所述，本實驗旨在為臨床或?qū)嶒炑芯靠s短反復(fù)培養(yǎng)鑒定BMSCs的實驗周期，采用密度梯度離心法成功獲得純度較高的兔BMSCs，在其處于最佳狀態(tài)時給予凍存復(fù)蘇檢測其生物特征及成骨能力是否受到影響。本研究結(jié)果顯示，兔BMSCs在短期凍存后其增殖、生物特征及成骨分化潛能無明顯變化，復(fù)蘇后可用于進一步研究和應(yīng)用。

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