浦香蘭，李松

(江陰天江藥業(yè)有限公司，江蘇 江陰 214434)

中藥工業(yè)

荔枝核配方顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究△

浦香蘭*，李松

(江陰天江藥業(yè)有限公司，江蘇 江陰 214434)

目的：對(duì)荔枝核配方顆粒的質(zhì)量控制方法進(jìn)行研究，建立荔枝核配方顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法：采用薄層色譜法(TLC)對(duì)荔枝核配方顆粒中皂苷類成分及原兒茶酸進(jìn)行定性鑒別；采用高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定荔枝核配方顆粒中原兒茶酸的含量。色譜柱為 Megres-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為乙腈-1%冰醋酸溶液(5∶95)，檢測(cè)波長(zhǎng)為260 nm，進(jìn)樣量為10 μL，流速為1.0 mL·min-1，柱溫為30 ℃。結(jié)果：薄層色譜法能特異性地鑒別荔枝核配方顆粒中皂苷類成分和原兒茶酸；原兒茶酸的定量測(cè)定在0.055 74～0.557 4 μg呈良好的線性關(guān)系(r=0.999 9)；平均加樣回收率100.25%(RSD=2.15%)。結(jié)論：本方法可準(zhǔn)確地進(jìn)行定性、定量檢測(cè)，且操作簡(jiǎn)便、靈敏、專屬性強(qiáng)、重現(xiàn)性好，原兒茶酸峰達(dá)到很好的基線分離，可作為荔枝核顆粒的質(zhì)量控制方法。

荔枝核；配方顆粒；TLC；HPLC；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；原兒茶酸

荔枝核為無(wú)患子科植物荔枝LitchichinensisSonn.的干燥成熟種子。其味甘、微苦，性溫。歸肝、腎經(jīng)，具有行氣散結(jié)、祛寒止痛的功能，用于寒疝腹痛，睪丸腫痛[1]。根據(jù)研究，荔枝核的主要化學(xué)成分為荔枝核皂苷、黃酮類、揮發(fā)油、有機(jī)酸及酯、氨基酸、糖類及微量元素等[2-5]。劉興前等[6-7]報(bào)道，荔枝核萃取物的水溶性部位中含有原兒茶酸。現(xiàn)代藥理學(xué)表明，荔枝核具有抗氧化、調(diào)血脂、降血糖、抗肝損傷和抑制乙肝病毒等藥理作用[8]。

目前對(duì)于荔枝核的研究，主要是針對(duì)荔枝核藥材的化學(xué)成分、提取工藝及藥理學(xué)，對(duì)于質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)方面的研究極少；《中國(guó)藥典》2010年版一部中，荔枝核項(xiàng)下沒有薄層鑒別方法，也沒有含量測(cè)定方法；對(duì)于荔枝核配方顆粒的研究尚未見報(bào)道。

荔枝核配方顆粒由荔枝核飲片經(jīng)提取、濃縮、干燥、制粒等工序制成，它突破了傳統(tǒng)中藥飲片需要煎煮的服用模式，具有免煎易服、易儲(chǔ)存、攜帶方便等優(yōu)點(diǎn)[9]。為保證荔枝核配方顆粒質(zhì)量穩(wěn)定均一，確保臨床用藥安全有效，本文應(yīng)用薄層色譜法建立了荔枝核配方顆粒的薄層鑒別方法，采用高效液相色譜法對(duì)荔枝核配方顆粒中主要有效成分原兒茶酸(C7H6O4)進(jìn)行含量測(cè)定。

1 儀器與試藥

1.1儀器

Agilent1260高效液相色譜儀(Agilent-G1311A四元泵；Agilent-G1322A真空脫氣器；Agilent-G1314B可變波長(zhǎng)檢測(cè)器；CHEMSTATIONB.04.02化學(xué)工作站)；AT-330型柱溫箱(天津奧特賽恩斯科學(xué)儀器有限公司)；十萬(wàn)分之一電子天平(瑞士Mettler公司)；超聲清洗機(jī)(無(wú)錫超聲電子設(shè)備廠)；CAMAGTLCVISUALIZER薄層成像系統(tǒng)(瑞士CAMAG公司)；超聲清洗機(jī)(蘇州昆山超聲電子設(shè)備廠)。

1.2試藥

原兒茶酸對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110809-201205，供含量測(cè)定用，含量以99.9%計(jì))。荔枝核藥材購(gòu)于廣西玉林鑫康藥材有限公司，經(jīng)江陰天江藥業(yè)有限公司唐波高級(jí)工程師鑒定為無(wú)患子科植物荔枝LitchichinensisSonn.的干燥成熟種子，作為對(duì)照藥材。硅膠G(青島海洋化工廠)，硅膠GF254(青島海洋化工廠)，乙腈為色譜純，水為重蒸餾水，其他試劑均為分析純。

荔枝核配方顆粒(江陰天江藥業(yè)有限公司，批號(hào)：1004104，1012296，1104055，1109115，1201108，1210098，1303125，1305053，1308150)。

2 方法與結(jié)果

2.1薄層色譜定性鑒別

2.1.1皂苷類成分的薄層鑒別 取本品顆粒1g，加水25mL溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取2次，每次30mL，合并正丁醇液，置水浴上蒸干，殘?jiān)蛹状?mL使溶解，作為供試品溶液。另取荔枝核對(duì)照藥材約10g，加水100mL，煮沸30min，濾過，濾液蒸干，加水25mL，同法制成對(duì)照藥材溶液。照薄層色譜法(《中國(guó)藥典》2010年版一部附錄ⅥB)試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各10μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水(15∶40∶22∶10)在5～10℃放置12h的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。見圖1。

1～9.荔枝核配方顆粒 S.荔枝核對(duì)照藥材圖1 荔枝核配方顆粒中皂苷類成分TLC圖

2.1.2原兒茶酸的薄層鑒別 取本品顆粒1g，加水25mL溶解，用乙酸乙酯振搖提取2次，每次30mL，合并乙酸乙酯液，置水浴上蒸干，殘?jiān)蛹状?mL使溶解，作為供試品溶液。另取荔枝核對(duì)照藥材10g，加水100mL，煮沸30min，濾過，濾液蒸干，加水25mL，同法制成對(duì)照藥材溶液。另取原兒茶酸對(duì)照品，加甲醇制成每1mL含0.5mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法(《中國(guó)藥典》2010年版一部附錄ⅥB)試驗(yàn)，吸取上述3種溶液各5μL，分別點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲苯-甲酸(5∶6∶3∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，置254nm紫外光燈下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材和對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。見圖2。

1～9.荔枝核配方顆粒；S1.荔枝核對(duì)照藥材；S2.原兒茶酸圖2 荔枝核配方顆粒中原兒茶酸TLC圖

2.2含量測(cè)定

2.2.1色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性 色譜柱Megres-C18(HanbonSci.&Tech.，250mm×4.6mm，5μm)；流動(dòng)相：乙腈-1%冰醋酸溶液(5∶95)；檢測(cè)波長(zhǎng)：260nm；進(jìn)樣量：10μL；流速：1.0mL·min-1；柱溫：30℃。理論板數(shù)按原兒茶酸峰計(jì)應(yīng)不低于3000。色譜圖見圖3。

1.原兒茶酸圖3 荔枝核配方顆粒及對(duì)照品HPLC圖

2.2.2對(duì)照品溶液的制備 取原兒茶酸對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇-1%冰醋酸溶液(70∶30)混合溶液制成每1mL含60μg的溶液，即得(55.74μg·mL-1)。

2.2.3供試品溶液的制備 取荔枝核配方顆粒適量，研細(xì)，取約0.5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇-1%冰醋酸溶液(70∶30)混合溶液25mL，密塞，稱定重量，超聲處理(功率250W，頻率50KHz)30min，放冷，再稱定重量，用甲醇-1%冰醋酸溶液(70∶30)混合溶液補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4線性關(guān)系考察 分別精密吸取原兒茶酸對(duì)照品(55.74μg·mL-1)1，2，4，6，8，10μL，注入液相色譜儀，按上述色譜條件測(cè)定，以原兒茶酸的峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，以原兒茶酸的進(jìn)樣量(X，μg)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得回歸方程：Y=3775.7636X+2.3236，r=0.9999，表明原兒茶酸進(jìn)樣量在0.05574～0.5574μg與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.2.5精密度試驗(yàn) 精密吸取原兒茶酸對(duì)照品溶液(55.74μg·mL-1)10μL，按上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積，計(jì)算原兒茶酸峰面積的RSD=0.29%，表明儀器精密度良好。

2.2.6穩(wěn)定性試驗(yàn) 取荔枝核配方顆粒(批號(hào)：1004104)，按2.2.3供試品溶液制備項(xiàng)下操作制成供試品溶液，按上述色譜條件，分別在0，2，4，8，12，24h精密吸取10μL進(jìn)樣，記錄原兒茶酸的峰面積，計(jì)算RSD值，結(jié)果RSD=0.66%，表明供試品溶液在24h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.2.7重復(fù)性試驗(yàn) 取荔枝核配方顆粒(批號(hào)：1004104)，平行6份，分別按2.2.3供試品溶液制備項(xiàng)下操作制成供試品溶液。按上述色譜條件測(cè)定原兒茶酸峰面積，計(jì)算含量以及RSD值。結(jié)果表明，原兒茶酸的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.55mg·g-1，RSD=0.99%。

2.2.8加樣回收試驗(yàn) 取已知含量的本品顆粒(批號(hào)：1004104)適量，研細(xì)，取約0.25g，平行6份，精密稱定，分別精密加入原兒茶酸對(duì)照品溶液(55.74μg·mL-1)7mL，按2.2.3供試品溶液制備項(xiàng)下操作制成供試品溶液，按上述色譜條件測(cè)定原兒茶酸峰面積，計(jì)算回收率，結(jié)果見表1。

表1 荔枝核配方顆粒中原兒茶酸回收率試驗(yàn)

注：原兒茶酸對(duì)照品加入量均為0.390 2 mg

2.2.9 樣品測(cè)定結(jié)果 取不同批次荔枝核配方顆粒，按2.2.3供試品溶液制備項(xiàng)下方法制成供試品溶液，每批平行2份，測(cè)定峰面積，計(jì)算原兒茶酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果見表2。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，規(guī)定本品按干燥品計(jì)算，含原兒茶酸(C7H6O4)不得少于 1.00 mg·g-1。

表2 荔枝核配方顆粒中原兒茶酸的測(cè)定

3 討論

在研究荔枝核配方顆粒的定性鑒別方法時(shí)，針對(duì)荔枝核的化學(xué)成分，分別建立了對(duì)荔枝核皂苷成分和原兒茶酸的定性鑒別方法。在實(shí)驗(yàn)過程中，通過對(duì)供試液的不同提取方式、不同薄層板、不同展開系統(tǒng)、不同顯色方法等進(jìn)行一系列方法學(xué)考察，以及在不同溫濕度條件下的耐用性試驗(yàn)，最終確定了文中所列鑒別方法。

根據(jù)荔枝核中含有的化學(xué)成分，考慮到荔枝核配方顆粒為水提取物，最終選擇具有抗菌作用的原兒茶酸作為荔枝核配方顆粒含量測(cè)定的指標(biāo)成分。本實(shí)驗(yàn)參考《中國(guó)藥典》2010年版一部狗脊項(xiàng)下【含量測(cè)定】方法對(duì)荔枝核配方顆粒中原兒茶酸進(jìn)行含量測(cè)定研究。在研究過程中考察了超聲提取、水浴回流提取、振搖提取等不同的提取方式，發(fā)現(xiàn)差異不大，考慮到操作的簡(jiǎn)便性，采用超聲提取的方式；同時(shí)考察了不同溶劑[甲醇、70%甲醇、50%甲醇、70%乙醇、稀乙醇及甲醇-1%冰醋酸溶液(70∶30)混合溶液]和提取時(shí)間(10，20，30，40 min)，結(jié)果表明以甲醇-1%冰醋酸溶液(70∶30)混合溶液超聲處理30 min能較完全地將有效成分提取出來(lái)。

采用二極管陣列檢測(cè)器對(duì)原兒茶酸對(duì)照品溶液進(jìn)行掃描，發(fā)現(xiàn)原兒茶酸在225 nm和260 nm附近均有較強(qiáng)吸收，因此在225 nm左右和260 nm左右共選擇8個(gè)波長(zhǎng)對(duì)樣品和對(duì)照品進(jìn)行檢測(cè)，并計(jì)算含量，結(jié)果顯示在225 nm附近，含量差異比較大，在260 nm附近含量基本無(wú)差異，最后選擇參考《中國(guó)藥典》2010年版一部狗脊項(xiàng)下【含量測(cè)定】方法，選擇260 nm作為原兒茶酸的檢測(cè)波長(zhǎng)。

經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明，該方法簡(jiǎn)便快捷、重復(fù)性好、結(jié)果滿意，可為控制荔枝核配方顆粒的質(zhì)量提供科學(xué)依據(jù)，同時(shí)為藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定提供參考。

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QualitystandardofFormulaGranuleofLitchisemen

PU Xianglan*，LI Song

(Jiangyin Tianjiang pharmaceutical Co.，Ltd.，Jiangyin 214434，China)

Objective：To study and establish the quality standard of formula granules of Litchi semen.Methods：Formula Granule of Litchi semen were identified by Thin-layer Chromatography(TLC).Protocatechic acid was determined by High Performance Liquid Chromatography(HPLC).The chromatographic column was Megres-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；the mobile phase was acetonitrile-1% acetic acid solution(5∶95)；the detection wavelength was 260 nm；the sample size was 10 μL；the flow rate was 1.0 mL·min-1and the column temperature was 30 ℃.Results：The TLC spots were clear and well divided.Protocatechic acid had good linear relationship in the range of 0.055 74-0.557 4 μg withr=0.999 9，the average recovery was 100.25% with RSD=2.15%.Conclusion：The methods were accurate，simple and reproducible.It could be used for the quality control of Formula Granule of Litchi semen.

Litchi semen；Formula granule；TLC；HPLC；Quality standard；Protocatechic acid

江蘇省科技成果轉(zhuǎn)化專項(xiàng)資金項(xiàng)目——600味中藥配方顆粒的研究與產(chǎn)業(yè)化(BA2009027)

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浦香蘭，工程師，研究方向：中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；E-mail：puxl@tianjiang.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2014.10.012

2014-02-12)