盛曉靜，楊群，祝興勇，張曉云

(九江市食品藥品檢驗(yàn)所，江西 九江 332000)

HPLC-ELSD同時(shí)測(cè)定柿葉中齊墩果酸及熊果酸含量

盛曉靜*，楊群，祝興勇，張曉云

(九江市食品藥品檢驗(yàn)所，江西 九江332000)

目的：建立測(cè)定柿葉中齊墩果酸和熊果酸含量的高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)法(HPLC-ELSD)。方法：以甲醇為提取溶劑，色譜柱為WatersSunFireTMC18(250mm×4.6mm，5μm)，流動(dòng)相為乙腈-甲醇-1.0%醋酸銨溶液(55∶25∶20)，流速為1.0mL·min-1，柱溫為25℃。蒸發(fā)光散射檢測(cè)器漂移管溫度為90℃，氣體壓力為0.17MPa。結(jié)果：齊墩果酸的量在0.1325～1.656μg呈良好線性關(guān)系(r=0.9998)，回收率為98.86%；熊果酸的量在0.3704～4.630μg呈良好線性關(guān)系(r=0.9986)，回收率為98.88%。結(jié)論：所建立的方法簡(jiǎn)單準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，可用于柿葉的質(zhì)量控制。

柿葉；齊墩果酸；熊果酸；高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)法；含量測(cè)定

柿葉為柿科植物柿DiospyroskakiThunb.的干燥葉，具有清肺止咳，涼血止血，活血化瘀，降血壓的功能。用于咳喘，肺氣脹，各種內(nèi)出血，高血壓，腦動(dòng)脈硬化癥，冠心病[1]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，柿葉含有萘酮類(lèi)、黃酮類(lèi)、萜類(lèi)、鞣質(zhì)、谷山醇類(lèi)、酚類(lèi)、香豆素類(lèi)、有機(jī)酸、胡蘿卜素和維生素C等化學(xué)成分[2-3]。齊墩果酸和熊果酸為柿葉中的五環(huán)三萜類(lèi)化合物，齊墩果酸具有消炎、增強(qiáng)免疫力、抑制血小板降集、降糖等多方面的藥理作用，熊果酸具有強(qiáng)心、降血脂、降血糖、抗癌等藥理作用，尤其在抗腫瘤、抗氧化、抗炎保肝、降血脂方面的作用顯著[2-6]。由于齊墩果酸與熊果酸在紫外區(qū)均為末端吸收，采用高效液相色譜-紫外檢測(cè)器法(HPLC-UV)測(cè)定時(shí)干擾較大，筆者采用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)法(HPLC-ELSD)同時(shí)測(cè)定柿葉中齊墩果酸與熊果酸的含量，方法簡(jiǎn)單準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，可用于柿葉的質(zhì)量控制。

1 儀器與試藥

1.1儀器

Waters高效液相色譜儀(e2695型分離模塊，2424型蒸發(fā)光散射檢測(cè)器，Empower工作站)；SartoriusBp211D分析天平；YIY-UL300W-C型超聲波清洗器。

1.2試藥

齊墩果酸、熊果酸對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)分別為110709-200304，110742-200517)；重蒸水，色譜乙腈，色譜甲醇，其他試劑均為分析純。

10批柿葉藥材的來(lái)源及產(chǎn)地信息見(jiàn)表1，均經(jīng)九江市食品藥品檢驗(yàn)所中藥室鑒定為柿科植物柿DiospyroskakiThunb.的干燥葉。

表1 10批柿葉藥材的來(lái)源及產(chǎn)地信息

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：WatersSunFireTMC18(250mm×4.6mm，5μm)；柱溫：25℃；流動(dòng)相：乙腈-甲醇-1.0%醋酸銨溶液(55∶25∶20)，流速：1.0mL·min-1；蒸發(fā)光散射檢測(cè)器：霧化器溫度為30℃，漂移管溫度為90℃，載氣為氮?dú)猓瑲怏w壓力0.17MPa。理論塔板數(shù)按齊墩果酸峰計(jì)算不低于10000，齊墩果酸與熊果酸均能有效分離且峰形較好。

2.2混合對(duì)照品溶液的制備

精密稱(chēng)取齊墩果酸對(duì)照品8.28mg、熊果酸對(duì)照品15.43mg，分別置于25mL量瓶中，加甲醇適量使其溶解，并稀釋至刻度，搖勻，分別作為齊墩果酸及熊果酸對(duì)照品母液；再精密吸取齊墩果酸對(duì)照品母液2mL、熊果酸對(duì)照品母液3mL置同一10mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3供試品溶液的制備

取柿葉樣品粉末(過(guò)二號(hào)篩)約1g，精密稱(chēng)定，置于具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25mL，密塞，稱(chēng)定重量，超聲處理(功率240W，頻率40kHz)30min，放冷，再稱(chēng)定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.4測(cè)定方法

分別精密吸取混合對(duì)照品溶液5，20μL，供試品溶液10μL，注入液相色譜儀，測(cè)定，用外標(biāo)兩點(diǎn)法對(duì)數(shù)方程計(jì)算，即得。

2.5線性關(guān)系的考察

取混合對(duì)照品溶液2，5，10，20，25μL分別注入高效液相色譜儀，測(cè)定峰面積。以進(jìn)樣量的常用對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，以峰面積的常用對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并進(jìn)行回歸分析，得齊墩果酸回歸方程為Y=5774.4X+1252.1，r=0.9998，結(jié)果表明齊墩果酸的量在0.1325～1.656μg呈良好線性關(guān)系；得熊果酸回歸方程為Y=5753.3X+1320.3，r=0.9986，結(jié)果表明熊果酸的量在0.3704～4.630μg呈良好線性關(guān)系。

2.6精密度試驗(yàn)

精密吸取對(duì)照品混合溶液10μL進(jìn)樣，重復(fù)進(jìn)樣5次，按上述色譜條件測(cè)定，齊墩果酸峰面積對(duì)應(yīng)常用對(duì)數(shù)值的RSD=0.10%，熊果酸峰面積對(duì)應(yīng)常用對(duì)數(shù)值的RSD=0.07%，結(jié)果表明本方法的精密度良好。

2.7穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取同一份供試品溶液10μL(10號(hào)樣品)，分別于0，2，4，6，8，10h按上述方法進(jìn)樣分析，測(cè)定齊墩果酸及熊果酸峰面積常用對(duì)數(shù)值的RSD分別為0.13%，0.06%，結(jié)果表明供試品溶液在10h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批柿葉樣品(10號(hào)樣品)，按上述方法操作，平行試驗(yàn)6次，測(cè)得齊墩果酸平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.263%，RSD=1.03%；熊果酸平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.700%，RSD=1.29%。結(jié)果表明，在同一條件下，6次測(cè)得樣品含量一致，本方法重復(fù)性良好。

2.9回收率試驗(yàn)

采用加樣回收法，精密稱(chēng)取2.8中已測(cè)定含量的柿葉樣品6份，分別精密添加一定量的齊墩果酸及熊果酸對(duì)照品，按2.3方法制成供試品溶液，各精密吸取10μL進(jìn)樣，測(cè)定齊墩果酸及熊果酸含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 柿葉中齊墩果酸及熊果酸加樣回收試驗(yàn)

2.10樣品測(cè)定

取10批不同來(lái)源的柿葉樣品，按上述色譜條件和方法測(cè)定齊墩果酸及熊果酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，色譜圖見(jiàn)圖1，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。

A.齊墩果酸及熊果酸對(duì)照品 B.柿葉樣品1.齊墩果酸 2.熊果酸圖1 柿葉及對(duì)照品HPLC圖

表3 柿葉樣品中齊墩果酸及熊果酸的測(cè)定/%

3 討論

經(jīng)查閱文獻(xiàn)[7-8]，齊墩果酸及熊果酸的提取溶劑常用甲醇及乙醇，提取方法可用超聲波提取。因此，我們比較了乙醇及不同濃度甲醇的提取效果，結(jié)果顯示以甲醇提取的含量最高，并通過(guò)溶劑加入量和提取時(shí)間的考察，確定取樣量為1 g時(shí)，以甲醇25 mL超聲處理(功率240 W，頻率40 kHz)30 min的提取效果最佳。

齊墩果酸和熊果酸均為五環(huán)三萜類(lèi)化合物，兩者互為同分異構(gòu)體，性質(zhì)十分相似，不易分離，我們?cè)谘芯恐蟹謩e考察了甲醇-水(85∶15)、甲醇-0.5醋酸銨溶液(85∶15)、乙腈-水(70∶30)、乙腈-甲醇-1.0%醋酸銨溶液(55∶25∶20)等流動(dòng)相對(duì)齊墩果酸及熊果酸的分離效果，結(jié)果以流動(dòng)相乙腈-甲醇-1.0%醋酸銨溶液(55∶25∶20)分離效果最好。

實(shí)驗(yàn)所建立的齊墩果酸和熊果酸含量測(cè)定方法簡(jiǎn)單準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，可用于柿葉的質(zhì)量控制。10批柿葉齊墩果酸及熊果酸含量測(cè)定的結(jié)果顯示，齊墩果酸含量較高的樣品含熊果酸的量也高，兩種成分的含量存在一定的相關(guān)性。通過(guò)比較自采的5批樣品含量測(cè)定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，由于采收期的不同，柿葉中齊墩果酸及熊果酸含量存在一定差異，以秋季果實(shí)成熟后采收的樣品含量較高。

[1] 江西省食品藥品監(jiān)督管理局.江西省中藥飲片炮制規(guī)范[S].2008版.上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，2009：212.

[2] 姜紅波，趙衛(wèi)星，馮國(guó)棟，等.柿葉的主要有效成分及藥理作用研究進(jìn)展[J].化工時(shí)刊，2010，24(6)：38-44.

[3] 林嬌芬，林河通，謝聯(lián)輝，等.柿葉的化學(xué)成分、藥理作用、臨床應(yīng)用及開(kāi)發(fā)利用[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2005，31(7)：90-96.

[4] 張明發(fā)，沈雅琴.齊墩果酸和熊果酸的抗炎及其變態(tài)反應(yīng)[J].抗感染藥學(xué)，2011，8(4)：235-240.

[5] 張明發(fā)，沈雅琴.齊墩果酸和熊果酸的抗糖尿病藥理[J].上海醫(yī)藥，2010，31(8)：347-350.

[6] 張明發(fā)，沈雅琴.齊墩果酸和熊果酸的保肝藥理研究進(jìn)展[J].抗感染藥學(xué)，2012，9(1)：13-19.

[7] 周江煜，侯小濤，黃天靜，等.廣西產(chǎn)柿葉質(zhì)量分析研究[J].中藥材，2012，35(1)：47-49.

[8] 張?zhí)m珍，巴寅穎，季思偉，等.RP-HPLC測(cè)定夏枯草不同部位熊果酸和齊墩果酸含量[J].藥物分析雜志，2009，29(9)：1547-1549.

SimultaneousDeterminationofOleanolicAcidandUrsolicAcidinKakiFoliumbyHPLC-ELSD

SHENG Xiaojing*，YANG Qun，ZHU Xingyong，ZHANG Xiaoyun

(Jiujiang Institute for Food and Drug Control，Jiujiang 332000，China)

Objective：To establish a high performance liquid chromatography-evaporative light scattering detector(HPLC-ELSD)method for the determination of oleanolic acid and ursolic acid in Kaki folium.Methods：The samples were extracted by methanol and the determination was performed on Waters SunFireTMC18column(250 mm×4.6 mm，5 μm)with mobile phase consisted of acetonitrile-methanol -1.0% ammonium acetate(55∶25∶20，V/V)at the flow rate of 1.0 mL·min-1and column temperature of 25 ℃，The detection was performed on an evaporative light scattering detector with the drift tube temperature of 90 ℃ and a gas pressure of 0.17 MPa.Results：Oleanolic acid showed a good linear relationship at the range of 0.132 5-1.656 μg(r=0.999 8).The average recovery was 98.86%.Ursolic acid showed a good linear relationship at the range of 0.370 4-4.630 μg(r=0.998 6). The average recovery was 98.88%.Conclusion：The established method is simple and accurate，with good reproducibility，and can be used for quality control of Kaki folium.

Kaki folium；Oleanolic acid；Ursolic acid；HPLC-ELSD；Content determination

*

盛曉靜，女，副主任中藥師，研究方向：中藥材及中成藥的質(zhì)量分析；Tel：(0792)8584361-103，E-mail：shengxj11@163.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2014.10.005

2014-03-06)