王麗麗，林余霖，陳曉辰，廖保生，王曉玥，金鉞，韓建萍

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所，北京 100193)

基于SNP位點鑒定藏菖蒲及其近緣種△

王麗麗，林余霖，陳曉辰，廖保生，王曉玥，金鉞，韓建萍*

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所，北京 100193)

目的：采用DNA條形碼技術(shù)和SNPs技術(shù)，快速準(zhǔn)確鑒定藏菖蒲及其近緣種、混偽品。方法：提取藏菖蒲及其近緣種的全基因組DNA，擴(kuò)增內(nèi)部第二轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal transcribed spacer 2，ITS2)并測序，測序結(jié)果用CodonCode Aligner 4.2.7拼接；基于隱馬爾科夫模型(Hidden Markov Model，HMM)注釋ITS2，采用MEGA5.1進(jìn)行序列比對，SNP位點查找、種內(nèi)主導(dǎo)變異分析和系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建。結(jié)果：通過對藏菖蒲同屬近緣種的96條ITS2序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)第23位和212位存在穩(wěn)定的SNP位點，可準(zhǔn)確鑒定藏菖蒲；藏菖蒲ITS2序列的種內(nèi)變異很小，僅在158位存在一個多拷貝位點。結(jié)論：該方法快速、準(zhǔn)確、特異性強(qiáng)，可用于藏菖蒲的鑒定。

藏菖蒲；DNA條形碼；鑒定；ITS2；SNPs

藏菖蒲為藏族習(xí)用藥材，天南星科植物藏菖蒲AcoruscalamusL.的干燥根莖。多年生草本，在亞洲、歐洲和北美洲均有分布[1]。藏菖蒲藥材有溫胃，消炎止痛的功效，用于補(bǔ)胃陽，治療消化不良，食物積滯，白喉，炭疽等癥[2]?，F(xiàn)代藥理研究表明藏菖蒲的主要活性成分為α-細(xì)辛醚和β-細(xì)辛醚，具有驅(qū)蟲、抗菌、抗癌、治療糖尿病、抗炎、降血脂、免疫調(diào)節(jié)、鎮(zhèn)靜等多種藥理作用，同時對消化系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)也有明顯的作用[3]。在我國藏菖蒲是藥食同源的重要物種，首載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，沿用至今。印度、北美等也廣泛用作調(diào)味料和蔬菜水果食用。但是由于藏菖蒲的活性成分α-細(xì)辛醚和β-細(xì)辛醚對人類的“三致”(致癌、致畸、致突變)毒性[4，5]，美國FDA(Food and Drug Administration)明令禁止食用藏菖蒲及其提取物。

藏菖蒲被列為一級瀕危藏藥藥材[6]，藥材資源缺乏，并且歷史上沿革已久，同屬多個物種均可藥用，導(dǎo)致名稱混亂。其與北美菖蒲A.americanus以及同屬物種石菖蒲A.tatarinowiiSchott、金錢蒲A.gramineusSoland.、香葉菖蒲A.xiangyeus、茴香菖蒲A.macrospadiceus、寬葉菖蒲A.latifolius等親緣關(guān)系很相近，屬易混淆品。并且藏菖蒲在藥材市場上有“藏菖蒲”、“水菖蒲”、“石菖蒲”等多種叫法，存在同物異名和同名異物的現(xiàn)象。另外，鳶尾科植物變色鳶尾Irisversicolor和虎耳草科巖白菜Bergeniapurpurascens亦混作藏菖蒲使用。目前藏菖蒲鑒定方法有形態(tài)學(xué)鑒定、顯微鑒定[7-8]、理化鑒別等[9-11]。鑒于傳統(tǒng)的性狀鑒別對藏菖蒲與其近緣種的鑒定比較困難，尤其對于藥材市場存在的藏菖蒲切片等的鑒別具有更大障礙。這就需要尋找到一種穩(wěn)定可靠的方法將藏菖蒲藥材、飲片加以鑒定區(qū)分。

DNA條形碼技術(shù)利用基因組中一段公認(rèn)的、相對較短的DNA片段，在核酸水平對物種進(jìn)行鑒定的分子生物學(xué)技術(shù)[12-13]，由加拿大分類學(xué)家Paul Hebert于2003年首次提出[14]。DNA條形碼技術(shù)具有簡便性、可重復(fù)性、方便性，可以實現(xiàn)對中藥材的準(zhǔn)確鑒定[15]。陳士林等驗證并確定了以ITS2為主，psbA-trnH為輔的植物類藥材DNA條形碼鑒定體系[13，16-22]，并且建立了中草藥的DNA條形碼鑒定系統(tǒng)，以供中醫(yī)藥企業(yè)使用，從源頭保證藥品質(zhì)量，避免由于藥材鑒定錯誤引發(fā)的中藥安全事件的發(fā)生[16]。近年來，DNA條形碼在與其他學(xué)科的結(jié)合方面發(fā)展迅速，例如結(jié)合化學(xué)方法對肉蓯蓉的鑒定[23]。同時，對于近緣種的鑒定，葉綠體基因組作為“超級條形碼”也越加受到關(guān)注[24]，以及陳曉辰等利用DNA條形碼序列開發(fā)出的人參、西洋參和三七等近緣種鑒定用的SNP位點[25]。

單核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)是指在基因組內(nèi)部單個核苷酸的變異，是繼限制性片段多態(tài)和微衛(wèi)星多態(tài)后的第三代遺傳標(biāo)記技術(shù)，目前已經(jīng)應(yīng)用于動植物物種鑒定[25]、遺傳圖譜構(gòu)建、特定基因與疾病的相關(guān)性研究和遺傳定位等[26-27]。單核苷酸多態(tài)性對于研究近緣物種的基因多態(tài)性具有很大的優(yōu)勢。本研究利用單核苷酸多態(tài)性(SNPs)對藏菖蒲進(jìn)行鑒定，確定了23 bp和212 bp兩處能準(zhǔn)確、穩(wěn)定鑒定藏菖蒲的堿基位點。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

藏菖蒲和石菖蒲樣品采集自武漢、華南等植物園，江西贛州市、江西廬山等主產(chǎn)區(qū)，藥材樣本來自西藏奇正藏藥股份有限公司、藥店和安國藥材市場等地，標(biāo)準(zhǔn)樣品由中國食品藥品檢驗所或者地方食品藥品檢驗所提供。實驗樣品經(jīng)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所林余霖研究員鑒定，葉片樣本經(jīng)硅膠干燥后保存?zhèn)溆?，憑證標(biāo)本存放于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所標(biāo)本館。樣本信息見表1。另從GenBank下載菖蒲屬全部ITS2序列，具體信息見表2。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 藥材樣本用75%乙醇擦洗表面，刮去外表皮，取內(nèi)部藥材40 mg左右，利用球磨儀(Retsch MM400，Germany)研磨2 min(30次/s)，使用天根生化科技(北京)有限公司的植物基因組DNA試劑盒提取總DNA。葉片樣本取20 mg左右，其他操作同藥材樣本操作流程。

1.2.2 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增及測序 引物序列為ITS2F：5’-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3’；ITS3R：5’-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3’，由上海生工生物有限公司(北京)合成。25 μL反應(yīng)體系：PCR Buffer(10×)2.5 μL，Mg2+2 μL(25 mmol·L-1)，dNTPs混合物2 μL(2.5 mmol·L-1)，引物各1.0 μL(2.5 μmol·L-1)，模板DNA 2 μL(～30 ng)，Taq DNA聚合酶1.0 U，加滅菌雙蒸水至25 μL，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)程序為：94℃變性5 min，反應(yīng)40個循環(huán)(94 ℃，30 s；56 ℃，30 s；72 ℃，45 s)，72 ℃延伸10 min。

表1 藏菖蒲、石菖蒲樣品信息

表2 GenBank中菖蒲屬及混偽品的全部ITS2序列信息

分別取5 μL的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物上樣，用1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，電泳后在凝膠成像儀上檢測結(jié)果。(圖1)PCR產(chǎn)物直接送上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行雙向測序，測序引物同PCR擴(kuò)增引物。

(CK為陰性對照，1-11分別代表樣品YC0046MT04-YC0046MT14)圖1 藏菖蒲PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖

1.2.3 數(shù)據(jù)處理 應(yīng)用軟件CodonCode Aligner 4.2.7進(jìn)行序列組裝和拼接。根據(jù)隱馬爾科夫模型模型，去除序列兩端5.8S和28S基因區(qū)，獲得完整的ITS2基因間隔區(qū)序列。應(yīng)用軟件MEGA5.1對拼接后的各個樣品以及GenBank中菖蒲屬植物的ITS2基因間隔區(qū)序列進(jìn)行SNP位點查找分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(NJ樹)，設(shè)置bootstrap(1000次重復(fù))檢驗分支支持率。

2 結(jié)果與分析

2.1 藏菖蒲種內(nèi)分析及SNP位點確定

Song等[28]對藏菖蒲ITS2基因組內(nèi)多拷貝進(jìn)行了高通量測序，結(jié)果表明主導(dǎo)變異C1占99.19%，其它均為次要變異，藏菖蒲種內(nèi)序列保守。本研究大樣本量的PCR產(chǎn)物測序結(jié)果也證實了21個實驗樣本中有20條是主導(dǎo)變異C1，僅有一條多拷貝引起的次要變異類型(見圖3)，GenBank上所有的17條藏菖蒲序列均為主導(dǎo)變異類型C1，因此，藏菖蒲的種內(nèi)和基因組內(nèi)變異較小，這將有助于藏菖蒲的SNP位點查找。

利用MEGA5.1對菖蒲屬ITS2基因間隔區(qū)序列進(jìn)行比對和SNP位點查找。比對后序列長度為215 bp，共發(fā)現(xiàn)2個SNP位點可以準(zhǔn)確鑒定藏菖蒲，分別為23 bp處C-T和212 bp處G-C/G-T(見表3)。即5’端起第23位為C和第212位為G，則鑒定為藏菖蒲，如果自5’端起第23位為T、第212位為C或T，則待鑒定樣品不是藏菖蒲。

圖2 藏菖蒲主導(dǎo)變異峰圖(C1)與次要變異峰圖(C2)

圖3 藏菖蒲種內(nèi)主導(dǎo)變異序列(C1)和次要變異序列(C2)

物種名拉丁名23bp212bp藏菖蒲A calamusCG藏菖蒲變種A americanusTT石菖蒲A tatarinowiiTT/C金錢蒲A gramineusTT香葉菖蒲A xiangyeusTT茴香菖蒲A macrospadiceusTT寬葉菖蒲A latifoliusTT金邊菖蒲A tatarinowiivar flavomarginatusTT

2.2 利用NJ樹鑒定藏菖蒲及其混偽品并驗證SNP位點鑒定結(jié)果

利用MEGA5.1構(gòu)建藏菖蒲混偽品及其近緣種的NJ樹(見圖4)，菖蒲屬物種、巖白菜、變色鳶尾可以分別聚為一支，支持率分別為57%、99%、99%；菖蒲屬中藏菖蒲單獨聚為一支，且支持率為92%，種內(nèi)的次要變異，通過支持率為64%的分支得到了體現(xiàn)。北美菖蒲與藏菖蒲聚為一支，支持率為90%，與植物分類學(xué)上北美菖蒲為藏菖蒲變種的結(jié)論一致。并且兩個物種可以與菖蒲屬其他物種明顯分開。以上結(jié)果表明，利用ITS2構(gòu)建NJ樹可以準(zhǔn)確鑒定藏菖蒲和菖蒲屬內(nèi)或者屬外混偽物種。

3 討論

3.1 SNP位點鑒定為鑒定藏菖蒲的重要方法

SNP分子標(biāo)記為第三代分子標(biāo)記技術(shù)，是個體差異在DNA水平的反映。陳曉辰等[25]已經(jīng)把SNP鑒定技術(shù)應(yīng)用于中藥材人參、西洋參的鑒定，并取得成功。本研究利用SNP鑒定藏菖蒲，發(fā)現(xiàn)兩個穩(wěn)定的SNP位點可以快速準(zhǔn)確鑒定藏菖蒲。本研究通過大樣本量的分析，得到在23 bp處C-T，212 bp處G-C/T兩個位點，可以用作快速穩(wěn)定鑒定藏菖蒲及其混偽品和近緣種的SNP位點。SNP分子標(biāo)記研究也為中藥材鑒定提供了新工具。

1.藏菖蒲 2.北美菖蒲 3.菖蒲屬物種 4.變色鳶尾 5.巖白菜 (bootstrap1000次重復(fù)，分支上的數(shù)值僅顯示自展支持率≥50%)圖4 基于ITS2構(gòu)建的藏菖蒲及其近緣種、混偽品系統(tǒng)進(jìn)化樹(NJ樹)

3.2 DNA提取和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中對溫度的要求

實驗樣本在干燥、儲存過程中，藥材的基因組DNA會有不同程度的降解，采用低溫延長水浴時間的方法提取到的DNA，質(zhì)量可以滿足實驗需求。另外，利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)特異擴(kuò)增藏菖蒲ITS2序列時，將退火溫度降低2～3 ℃，擴(kuò)增效率較高，更易于得到足夠量的PCR產(chǎn)物，進(jìn)而提高產(chǎn)物的測序成功率。

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MolecularAuthenticationoftheOrientalMedicineAcoruscalamusBasedonSNPMarkers

WANG Lili，LIN Yulin，CHEN Xiaochen，LIAO Baosheng，WANG Xiaoyue，HAN Jianping*

(NationalEngineeringLaboratoryforBreedingofEndangeredMedicinalmaterials，InstituteofMedicinalPlantDevelopment，ChineseAcademyofMedicinalScience&PekingUnionMedicinalCollege，Beijing100193，China)

Objective：The aim of this study is to investigate a simple and reliable method to authenticateAcoruscalamusaccording to DNA barcoding and SNPs.Methods：In this study we sequenced 47 internal transcribed spacer 2(ITS2)regions ofA.calamusandA.tatarinowii.was assembled by CodonCode Aligner 4.2.7 and annotated in accordance with HMM(Hidden Markov Model).MEGA5.1 was used to analyze all the 104 ITS2 sequences and detect single nucleotide polymorphisms(SNPs).Meanwhile，according to sequence diversity，a molecular phylogeny was constructed using neighbor-joining method.Intra-genomic variation ofA.calamusandA.tatarinowiiwere investigated and compared with sequences obtained via direct PCR sequencing.Results：Two stable single nucleotide polymorphism sites(SNPs)in ITS2 region were detected to identifyA.calamusand its adulterants.The constructed Neighbour-joining tree can also identifyA.calamus，which is consistent with the result of SNPs.The dominant variants inA.calamuspossessed approximately 99.19% in the genome.Only one subordinate variant was detected.The intraspecific and intragenomic divergence ofA.calamusare very small.Conclusion：SNPs could be used as an efficiently method to identifyA.calamusand its adulterants.

Acoruscalamus；DNA barcoding；identification；ITS2；SNPs

10.13313/j.issn.1673-4890.2014.11.004

2014-10-05)

國家自然科學(xué)基金資助項目(81473303)；863計劃(2012AA021602)：基于DNA條形碼的珍稀藥用、野生等資源快速檢測技術(shù)及產(chǎn)品研發(fā)；太白貝母甾體生物堿生物合成途徑的比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究

*

韓建萍，副研究員，主要研究方向：中藥資源及分子鑒定，Tel：(010)57833198，E-mail：jphan@implad.ac.cn