張新愛 申建忠 張帆 馬海樂 韓恩 董曉婭
摘要利用核酸適配體特異的分子識別功能以及特定熒光基團之間的能量轉移,建立了一種高靈敏度、高選擇性測定雌二醇的光譜方法。研究了緩沖溶液的pH值、組成和濃度、核酸濃度、實驗溫度及響應時間等因素對檢測雌二醇的影響。在最優(yōu)的實驗條件下(50 mmol/L BR緩沖溶液(pH 7.4),1.0×10mol/L核酸,實驗溫度45 ℃,響應時間19 min),體系熒光強度的改變值ΔI與雌二醇濃度的對數(shù)lgC呈良好的線性關系(r=0.9953),線性范圍為1.0×10將本方法用于檢測人體尿液中雌二醇的含量,雌二醇的加標回收率為94.0%~103.5%。
關鍵詞適配體; 熒光共振能量轉移; 雌二醇
1引言
雌二醇(17 βEstradiol)是一種天然類固醇雌激素,影響性特征的發(fā)展,在許多生理過程中起著至關重要的作用\[1\]。同時它也是一種重要的環(huán)境內分泌干擾物,可與共存的雌激素發(fā)生協(xié)同作用,促使雌激素活性增強\[2,3\]。雌二醇在人體的含量與乳腺癌等疾病有很大相關性,即使在很低的濃度下也有毒性或致癌作用\[4\]。
目前,雌二醇的檢測技術主要分為三類:(1)色譜法,包括高效液相色譜法(HPLC)\[5,6\]、液相色譜質譜聯(lián)用法(LCMS)\[7,8\],以及氣相色譜質譜聯(lián)用法(GCMS)\[9\],色譜法準確、可靠,但需要復雜的儀器,檢測成本高,樣品預處理復雜費時,衍生化還會造成目標類固醇的損失或降解,因此色譜法難以對大量樣品進行快速檢測,不能滿足現(xiàn)場檢測要求; (2)免疫學方法,包括酶聯(lián)免疫吸附分析法(ELISA)\[10\]、化學發(fā)光免疫法(CLEIA)\[11\]、熒光標記免疫法\[12\]等,這類方法基于抗原抗體特異性相互作用從而具有很高的選擇性,但因天然抗體穩(wěn)定性較差,免疫法容易出現(xiàn)假陽性的結果; (3)電化學分析方法\[13,14\],具有分析速度快、易于微型化、操作簡便等特點,但該技術多基于對電極表面的修飾,大都存在修飾層穩(wěn)定性和重現(xiàn)性差、傳質和電荷傳遞速率慢、選擇識別能力差等問題。
核酸適配體(Aptamer)是一段體外通過配體指數(shù)富集的系統(tǒng)進化(SELEX)技術篩選獲得的寡核苷酸片段,可以是RNA 或單鏈DNA。單鏈寡核苷酸的一些二級結構,如發(fā)夾、莖環(huán)結構等,可使核酸分子形成多種三維結構,成為與靶標物質特定區(qū)域結合的基礎。適配體能與DNA、RNA、蛋白質以及其它小分子靶物質特異性結合,具有親和力高、特異性強、容易制備及修飾、穩(wěn)定性好等特性,常被用于制備各種適配體傳感器\[15\]。
熒光共振能量轉移(Fluorescence resonance energy transfer,F(xiàn)RET) \[16\]是指在不同的熒光基團中,若一個熒光基團(供體)的熒光發(fā)射光譜與另一個基團(受體)的吸收光譜有一定的重疊,當兩個基團間的距離合適時(一般小于10 nm),即可觀察到熒光能量由供體向受體轉移的現(xiàn)象,即供體熒光猝滅和受體熒光增強。本研究以雌二醇適配體(P1)作為供受體之間的橋聯(lián)媒介,在適配體的兩條互補鏈(F1和F2)末端分別修飾上羧基熒光素(FAM)和羧基四甲基羅丹明(TAMRA),其中FAM作為熒光供體,TAMRA作為受體,用FRET法檢測雌二醇,實驗原理如圖1所示。當適配體P1不存在時,互補鏈F1FAM和F2TAMRA游離在溶液中(圖1a);向溶液中加入P1與F1和F2上堿基充分雜交后,F(xiàn)AM和TAMRA距離靠近,發(fā)生熒光能量轉移(圖1b);再加入目標物雌二醇,雌二醇與P1特異性的結合使F1和F2重新游離出來(圖1c),F(xiàn)AM熒光恢復。從而建立一種基于適配體FRET的高靈敏度及選擇性的檢測方法。
2實驗部分
2.1儀器與試劑
F4600型熒光光譜儀(日本日立公司),10 mL石英檢測池(Lightpath Optical Ltd., UK),雷磁PHS3C精密酸度計(上海儀電科學儀器股份有限公司),5804型離心機(德國Eppendorf公司),HH4型數(shù)顯恒溫水浴鍋(國華電器有限公司)。
3結果與討論
3.1FRET現(xiàn)象
當適配體P1不存在時,F(xiàn)AM標記的F1和TAMRA標記的F2鏈游離在溶液中,在485 nm的激發(fā)波長下,只能檢測到FAM在520 nm處的熒光(圖2a);向溶液中加入P1充分雜交后,520 nm處FAM的熒光強度降低,同時在580 nm處出現(xiàn)TAMRA明顯的發(fā)光(圖2b);再加入雌二醇與P1特異性結合后,引起520 nm發(fā)射光增強、580 nm發(fā)射光降低(圖2c)。對照實驗顯示,雌二醇對FAM沒有明顯的熒光增強作用
對TAMRA也無明顯的淬滅作用,說明FAM熒光增強是由于雌二醇與適配體P1結合導致F1和F2游離出來引起的。鑒于520 nm處的發(fā)射光比580 nm處的發(fā)光更靈敏,故以520 nm處熒光強度的改變ΔI作為定量依據(jù)。
3.2實驗條件對發(fā)光的影響
3.2.1緩沖溶液的pH值、種類和濃度的影響FAM和TAMRA間能否發(fā)生熒光能量轉移主要取決于適配體與其互補鏈的堿基配對,而堿基配對受pH的影響顯著,與緩沖介質的種類及濃度也相關
體系為研究對象,探討上述因素的影響。研究表明,在相同濃度下,與PBS緩沖液、TrisHCl緩沖液、NaHCO3Na2CO3緩沖液相比,在BR緩沖液中熒光信號最強且穩(wěn)定。改變BR的濃度進行實驗,濃度為50 mmol/L 時熒光最強。向體系中加入雌二醇,記錄不同pH值下ΔI值,結果表明,pH 7.4時可獲得最大的ΔI值。綜合以上實驗結果,本研究選擇pH 7.4的50 mmol/L BR緩沖溶液作為分析底液。
3.2.2核酸濃度的影響
分別測定適配體P1與其互補鏈F1和F2濃度為5.0×10, 1.0×10 mol/L時體系發(fā)光情況。隨著核酸濃度增加,F(xiàn)1/F2/P1體系發(fā)光強度迅速增加,當核酸濃度高于1.0×10 mol/L時,發(fā)光強度增加幅度降低,考慮本底發(fā)光強度較大會增大實驗誤差,且高濃度下堿基錯配的幾率增大,故選擇1.0×10mol/L作為最佳核酸濃度。在此濃度下FAM的發(fā)光強度能夠滿足實驗需要,且加入雌二醇溶液后520 nm處熒光改變值ΔI最大。
3.2.3實驗溫度的影響溫度決定核酸鏈雜交的速率和雜交雙鏈的穩(wěn)定性。分別記錄25, 30, 35, 40, 45, 50和60 ℃下F1/F2/P1/雌二醇體系的熒光強度。隨溫度升高,熒光呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢,45 ℃時熒光最強。推測溫度不僅影響核酸的構型,同時也影響供體FAM的熒光效率,溫度升高FAM熒光效率下降,導致向受體TAMRA轉移的能量降低\[18\]。因此選擇45 ℃作為最佳工作溫度。
3.2.4熒光體系的響應時間和穩(wěn)定性研究
分別考察培養(yǎng)時間對F1/F2/P1體系以及加入雌二醇后發(fā)光強度的影響。向F1/F2溶液中加入P1后,在0~15 min內,520 nm處熒光強度隨時間逐漸降低,580 nm處熒光強度逐漸增大, 15 min以后熒光幾乎不再變化,說明適配體P1與其互補鏈F1和F2已雜交完全。再向該體系中加入雌二醇,520 nm處熒光增大,4 min后達穩(wěn)定,說明適配體P1能夠快速地識別雌二醇,顯示P1與雌二醇之間高的親和性。實驗結果表明,在20 min內能夠完成對體系熒光變化的測定。
將含有F1/F2/P1/雌二醇的BR緩沖溶液密封,在4 ℃避光儲存,2天后檢測,熒光信號沒有顯著的變化; 5天后,熒光強度下降5.8%,表明此體系具有良好的穩(wěn)定性,能夠彌補不適合現(xiàn)場檢測的不足。
另外,對儀器參數(shù)也進行了優(yōu)化,選擇光電倍增管高壓為700 V,激發(fā)和發(fā)射狹縫均為10 nm。
3.3雌二醇的線性響應范圍和檢出限
在最優(yōu)的實驗條件下,檢測不同濃度的雌二醇對1.0×10
mol/L的發(fā)光體系平行測定5次,結果的相對標準偏差(RSD)小于3.3%。與雌二醇常用檢測方法的對比結果(表1)表明,本方法將適配體的特異性識別與FRET技術結合,具有較高的靈敏度和分析效率。mol/L雌二醇的發(fā)光體系, 當控制熒光強度變化在±5%以內,1000倍的CaCl2, MgCl2, KH2PO4, Na2SO4, NaCl, KNO3和NH4Cl,450倍的肌酸酐、葡萄糖、果糖,300倍的尿素、L酪氨酸、L組氨酸、L賴氨酸、L纈氨酸、甘氨酸,200倍的尿酸、抗壞血酸,50倍的Al3+、Fe3+(50倍),25倍的Pb2+、Cd2+、Ni2+、Hg2+對體系沒有干擾。重金屬離子對該發(fā)光體系的干擾稍大,推測重金屬離子與核酸結合后,使核酸構型改變,單鏈結構發(fā)生折疊,阻礙適配體與互補鏈堿基配對,引起FAM與TAMRA之間距離改變,不利于兩者之間熒光能量轉移。實際樣品中重金屬離子含量遠低于實驗所用濃度。因此,本方法具有較好的選擇性和抗干擾能力。
3.5實際樣品分析
將本方法用于人體尿液中雌二醇含量的檢測,樣品取自5名志愿者,未經任何前處理直接檢測,每個樣品平行測定3次取其平均值,結果在5.9×10
Symbolm@@ 10 mol/L之間,均在正常值范圍內,如表2所示,在每個樣品中加入雌二醇進行精密度和回收率實驗,平行測定5次,相對標準偏差(RSD)為3.3%~6.7%, 回收率為94.0%~103.5%。由此可見,本方法具有較高的準確度和精密度,適合實際樣品分析。4結論
本研究利用核酸適配體對目標分子特定的識別能力,結合熒光共振能量轉移法測定雌二醇,實驗表明,本方法能夠抵抗高濃度無機鹽、糖類、氨基酸、尿酸等生理體系中共存物質的干擾,具有較高的靈敏度、選擇性、重現(xiàn)性以及穩(wěn)定性,適合實際樣品分析,為小分子檢測提供了一種新思路。
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18Liu H L, Wang Y H, Shen A G, Zhou X D, Hu J M. Talanta, 2012, 93(15): 330-335
AbstractA highly sensitive fluorescence spectroscopic method was established for the selective determination of estradiol, which took advantages of the excellent molecular recognition capability of aptamer and the energy transfer between the specific fluorescent groups. The effects of the pH value, buffer constituent and concentration, the concentration of DNA, the experimental temperature and response time on the detection of estradiol were studied. Under the optimal conditions (50 mmol/L BR buffer solution with pH value at 7.4, 1.0×10 7 mol/L for each DNA strand, incubation at 45 ℃, response time 19 min), the change of the fluorescence intensity (ΔI) versus the logarithm of the concentration of estradiol (lgC) was linear over a concentration range from 1.0×10
mol/L with good linear correlation (r=0.9953). The limit of detection (LOD) was found to be 6.0×10mol/L (S/N=3). This method was successfully applied to the detection of estradiol in human urine, with the recovery in the range of 94.0%-103.5%. This method showed good precision and accuracy.
KeywordsAptamer; Fluorescence resonance energy transfer; Estradiol
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18Liu H L, Wang Y H, Shen A G, Zhou X D, Hu J M. Talanta, 2012, 93(15): 330-335
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KeywordsAptamer; Fluorescence resonance energy transfer; Estradiol